用于高效基因組編輯的rna分子的設計、合成及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及基因工程及核酸檢測領域。具體地說，本發明涉及可用病毒、微生物、 動植物等生物核酸序列的基因組編輯方法及用途。
【背景技術】：
[0002] 基因定點修飾一直是研究基因功能的重要手段之一，它也被用于人類遺傳性疾病 的治療中，因此這類技術成為現代分子生物學的研究熱點。早期僅基于同源重組的基因打 靶技術效率極低，應用受到限制。
[0003] 鋅指核酸酶（ZFN的）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENS)的出現讓科學家 們可以高效地進行基因定點修飾，被應用于斑馬魚、小鼠、大鼠、豬等動物模型中，實驗證明 它們可以高效準確地對基因進行定點修飾。但是這兩種技術所需的核酸序列，合成方法麻 煩，成本昂貴，無法進行大規模基因篩選。
[0004] 2013年初，在原核生物中，CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshort palindromicrepealsandCRISPRassociated)最新進展為基因定點修飾提供了一種制作 簡單、成本低廉、作用高效的方法。該系統在細菌和古細菌中用于降解入侵的病毒和質粒， 防止本體收到外來遺傳物質的損害。CRISPR/Cas系統一共分為三種類型，Cas9屬于研究相 對清楚的II型系統，研究證實在原核生物中，Cas9需要同兩種小RNA(crRNA、tracrRNA)結 合對外源核酸進行識別，直接剪切以達到保護自身的目的。科學家們為了能夠便于操作、簡 化實驗體系，將crRNA和tracrRNA融合成一條相對較長的gRNA，實驗證明，在哺乳動物細胞 內，Cas9由gRNA引導，可以對靶DNA進行剪切。
[0005] 現有技術存在的問題：現有的Cas9/gRNA對靶基因的切割效率較低，一般在5%~ 30%之間，應用會受到一定的限制。因此，開發新的gRNA，就成為本領域迫切需要解決的一 個技術問題。
【發明內容】
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[0006] 本發明的目的正是為了解決上述問題，希望通過對gRNA的結構進行一些改進，提 高Cas9/gRNA系統對靶向基因的切割效率。
[0007] 本發明所稱的"靶序列"是指gRNA5'端的20~24堿基的序列，這段序列與目的 DNA序列相同，gRNA需這段序列與目的DNA結合，cas9/gRNA復合體對目的DNA進行剪切。
[0008] 本發明所稱的"RNA二級結構"是指通過使用核酸二級結構預測軟件 RNAfold(Mathews等人（2004)，網址http: //rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold. cgi)預測得到的RNA二級結構。
[0009] 本發明所稱的"基因組編輯"是指對生物的基因組DNA進行刪除、插入或者替換， 從而達到對目的序列修改的目的。
[0010] 本發明采用的技術方案如下：
[0011] 本發明中設計針對HHB基因序列設計合成gRNA，采用的實驗方法是國際上比較常 用的突光素酶單鏈重組退火實驗（luciferasesingle-strandannealingrecombination assay，SSA)，和用來檢測內源基因非同源重組檢測效率的方法-SURVEYOR實驗。實驗原理 如附圖1、2所示。
[0012]gRNA是一個含有96堿基的RNA，如果用隨機合成的方法進行篩選，將會有496種可 能，篩選工作量過于龐大，無法進行。所以本發明中著眼于gRNA的第一個發卡結果進行篩 選，利用質粒不相容這一性質進行篩選。具體步驟如圖1所示。該方法首先建立篩選體系， 然后從第一個發卡結構中按順序選取4個堿基合成NNNN的隨機序列建立gRNA庫，將cas9 表達質粒和gRNA表達質粒與報告質粒一起共轉化進大腸桿菌，在其中挑選陽性克隆擴增， 最后與報告質粒再次共轉化進行驗證。我們設計的上述新方法使得篩選實驗的實驗量大大 減小，從而使得從大量可能的組合中挑選出有效的新型gRNA變得可行。
[0013] 使用上述方法，我們從上千種gRNA中挑選出了 10種最優選的增強cas9/gRNA效 果的gRNA，并且根據實驗結果合理概括出效果較好的gRNA結構。同時我們對現有的gRNA 的結構進行修改測試。
【附圖說明】
[0014] 圖1篩選實驗流程示意圖。我們將cas9和gRNA構建到同一個載體上，再通過共轉 化的方法，將其和報告基因的載體共轉化到同一個大腸桿菌內，有效果的gRNA會和cas9形 成復合體將含有報告基因載體上的靶序列剪切，此時會發生熒光素酶單鏈重組退火反應， 報告基因會表達。我們經過挑選報告基因表達的克隆來選取有效果的gRNA。為了進行大規 模篩選，我們將gRNA庫構建到載體上進行篩選，從中挑取陽性克隆，提取gRNA質粒，再進行 下游重新驗證。
[0015]圖 2 突光素酶單鏈重組退火實驗（luciferasesingle-strandannealing recombinationassay，SSA)原理圖：首先，把突光素酶基因進行改造。在突光素酶基因中間 加入終止密碼子和靶基因序列；隨后通過分子生物學手段再緊接上另外一段熒光素酶基因 序列，圖中淺灰色區域的序列（約800bp)相同。當gRNA有效果時，Cas9/gRNA復合體會在 靶序列位置把雙鏈DNA剪切形成一個雙鏈的DNA斷裂，由于兩個淺灰色區域序列（即圖1中 "終止密碼子"左側的一段基因和"靶序列"右側的一段基因）相同，此時會發生同源重組， 就形成了一個有活性的熒光素酶報告基因，實驗中可以測量熒光素酶的表達來檢測TALEN 的效果的強弱。
[0016] 圖3SURVEY0R原理圖：首先用PCR的方法把目的基因片段從基因組上擴增出來。 其中包括發生缺失和沒有產生變化的序列。然后把擴增出來的片段在體外進行重新退火， 此時發生缺失的片段和沒有產生變化的序列會退火形成有部分不配對的雙鏈結構。接下來 用SURVEYOR酶進行酶切實驗，這種酶可以識別不配對的區域進行酶切。我們可以通過跑膠 檢測圖中a、b、c的含量來檢測發生缺失的效率，從而得出TALEN的作用效果。
[0017] 圖4gRNA修改1序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第1個堿基由 G變為U，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA略有下降。
[0018] 圖5gRNA修改2序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第1個堿基由 G的配對序列由U突變為C，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA 基本不變。
[0019] 圖6gRNA修改3序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第1個堿基由 G的配對序列由U突變為A，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9沒有剪切活性。
[0020] 圖7gRNA修改4序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第1個堿基由 G突變為A，它的配對序列由U突變為A，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9沒有剪切活 性。
[0021] 圖8gRNA修改5序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第1個堿基由 G突變為U，它的配對序列由U突變為G，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9沒有剪切活 性。
[0022] 圖9gRNA修改6序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第3、4、5個堿 基由UUU突變為GCG，它們的配對序列由AAA突變為CGC，SSA結果和SURVEYOR結果顯示， cas9沒有剪切活性。
[0023] 圖IOgRNA修改7序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第3個堿基 U配對序列由A突變為C，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9沒有剪切活性。
[0024] 圖IlgRNA修改8序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第3、4、5個 堿基由UUU變為UU，它們的配對序列AAA變為AA，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9沒 有剪切活性。
[0025] 圖12gRNA修改9序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第7、8、9個 堿基由GAG變為ACU，他們的互補序列變為⑶C，將泡補齊，SSA結果和SURVEYOR結果顯示， cas9沒有剪切活性。
[0026] 圖13gRNA修改10序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第8個堿基 由A變為AAG，第21、22、23個堿基由AAG變為A，將泡方向改變，SSA結果和SURVEYOR結果 顯示，cas9沒有剪切活性。
[0027] 圖14gRNA修改11序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第21個堿基 A去掉，減少泡3'端的大小，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA 有下降。
[0028] 圖15gRNA修改12序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第21、22個 堿基AA去掉，減少泡3'端的大小，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9剪切效果相對原始 gRNA有下降。
[0029] 圖16gRNA修改13序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第8個堿基 A去掉，減少泡5'端的大小，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA 下降很明顯。
[0030] 圖17gRNA修改14序列及SSA和SURVEYOR實驗結果。將gRNA序列中第8個堿基 由A突變為G，SSA結果和SURVEYOR結果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA有所升高。
[0031] 圖18gRNAl序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0032] 圖19gRNA2序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0033] 圖20gRNA3序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0034] 圖21gRNA4序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0035] 圖22gRNA5序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0036] 圖23gRNA6序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0037] 圖24gRNA7序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0038] 圖25gRNA8序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0039] 圖26gRNA9序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
[0040] 圖27gRNA10序列及SSA和SURVEYOR實驗結果
【具體實施方式】
[0041] 以下將通過具體的實施例說明本發明，但是這些具體的實施例不應當理解為對本 發明的限制，對某些細節進行修改將仍然落入本發明的保護范圍之內。實施例中使用的 gRNA堿基序列、被上述gRNA識別的目標DNA中的片段的序列、以及cas9的氨基酸序列如 附錄所示。附錄中列出了 3組gRNA堿基序列和能被上述gRNA識別的DNA序列，實驗中使 用的gRNA堿基序列和對應的被gRNA識別的DNA序列是同一組的，但是并不限于某一個特 定的組。在實際應用的時候，一般是知道目標DNA序列后，選取目標DNA序列中的一段作為 gRNA的識別位點，然