氧化石墨烯作為rna保護試劑的新應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于RNA納米保護技術領域，特別涉及一種基于氧化石墨烯納米材料吸附功能的RNA保護策略，該方案能夠有效的阻斷RNA保存過程中酶促降解過程。
【背景技術】
[0002]核糖核酸(RNA)存在于細胞及部分病毒、類病毒當中，并行使遺傳信息載體的功能。其廣泛參與各項重要的生命歷程，對于生命活動的維系具有重要作用。根據RNA的功能可將RNA大致分為四類:l)mRNA:即信使RNA，主要功能是將DNA上的遺傳信息精確無誤地轉錄下來，以傳遞遺傳信息；2)tRNA:具有特異識別、轉運氨基酸功能；3)rRNA:核糖體的重要組成成分。4)microRNA:具有調控功能。由此可見，RNA在生物體內，對于生物體生命活性具有重要意義。為了實現RNA功能探索及生理意義相關研宄，通常需要對RNA進行分離純化，并將純化的RNA進行冷凍保存。然后，RNA的易降解性使RNA的保存面臨嚴峻的挑戰。目前，研宄者通常采用添加RNA酶抑制劑的方法，人為添加RNA酶抑制劑到RNA溶液當中，以降低或抑制RNA酶的催化活性，從而達到RNA保護的目的。但此類方法所需的RNA酶抑制物往往存在成本很高、運輸存儲困難、易變質、活性不穩定等問題。因此，開發新型的、易儲存運輸、活性穩定的RNA保護策略對于RNA保護及相關領域具有重要意義。
[0003]近年來，隨著納米技術的進步，納米材料已廣泛運用于生命科學領域。其中，氧化石墨烯更是成為了“明星”納米材料，并廣泛運用于電子學、材料學、診斷學等學科。眾所周知，氧化石墨烯能夠通過π-π堆疊效應，吸附核酸及蛋白質，產生固定化作用，而固定化作用導致的分子自由度的變化可能會引起酶促反應過程的巨變，可以產生酶促反應過程的阻斷。正如我們預想的那樣，我們在實驗過程中發現，在總RNA提取物中加入氧化石墨烯能夠延長RNA的儲存時間，氧化石墨烯似乎具有RNA保護功能。由此，我們對氧化石墨烯的RNA保護功能進行了深入的研宄，并發現氧化石墨烯通過固定RNA，在其表面形成一個保護界面，可以有效的阻止RNA酶對RNA的降解。同時，我們發現氧化石墨烯能夠固定RNA酶，固定后的RNA酶活性明顯降低。因此，氧化石墨烯的RNA保護功能是通過對RNA及RNA酶的吸附，阻斷了酶促反應過程而實現的。綜上，本發明發展了氧化石墨烯RNA保護策略，能夠克服當前RNA抑制劑保護方法存在的問題，其易于存儲運輸、性能穩定，通過后續實驗發現，氧化石墨稀能夠為RNA提供有效的保護。
【發明內容】
[0004]為了克服現有RNA保護技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種氧化石墨烯作為RNA保護試劑的新應用。本發明采用在RNA溶液中加入氧化石墨烯的方法，通過石墨烯的吸附作用，使RNA及RNA酶吸附在氧化石墨烯表面，從而使RNA酶的酶促反應過程得到抑制，達到RNA保護的目的。
[0005]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0006]氧化石墨烯作為RNA保護試劑的新應用，包括如下步驟:將氧化石墨烯與RNA樣品或RNA酶進行混合，震蕩混勻，并室溫放置5?15分鐘，得到氧化石墨烯RNA混合液或氧化石墨烯RNA酶混合液；使氧化石墨烯充分吸附RNA，達到保護RNA的目的；
[0007]所述的氧化石墨稀，與RNA樣品的質量比優選為1: (I?10)；
[0008]所述的氧化石墨稀，與RNA酶的比值優選為I μ g: (I?40U)；
[0009]所述的氧化石墨烯RNA混合液，在常溫下放置4天，RNA基本無降解；
[0010]所述的氧化石墨烯RNA酶混合液中，RNA酶活性大大降低，從而降低了 RNA酶對RNA的降解能力。
[0011]所述的氧化石墨烯作為RNA保護試劑的新應用，包括以下具體步驟:
[0012]1、總 RNA 提取:
[0013](I)選取單增李斯特菌作為研宄對象，取菌液離心去上清(原則上每17個細胞加入ImL TRIZOL，不能超過18個細胞，8000g，4°C離心2min，去掉上清液體，仔細將上清液吸取干凈，不要觸及EP管底部的細菌)
[0014](2)加入250 μ L，20mg/mL的溶菌酶(使用無RNA酶的TE溶解)吹打混勻，放入37°C的水浴鍋或者培養箱中孵育lOmin。
[0015](3)再加入ImL TRIZOL裂解液吹打混勻，再使用振蕩器震蕩，放置在常溫下6?1mino ( 一定要室溫靜置，靜置完畢后可以直接放入_80°C冰箱保存)。
[0016](4)往步驟(3)中已經備好的裂解液中加入氯仿(TRIZOL 1/5的體積量，一般200 μ L左右，最多300 μ L)蓋緊離心管蓋，劇烈震蕩，直到將混合液乳化成乳白色狀態。室溫靜置5min。
[0017](5)將上層無色液體轉移至一新的離心管中(上層液體吸取時盡量使用200 μ L的槍頭，盡量不要吸取到中間蛋白層，一般取600 μ L足矣)。
[0018](6)向吸取的上清液中加入0.5?I倍體積的異丙醇(最多750 μ L，并且異丙醇要置入-20°C冰箱中提前預冷)，上下顛倒混勻后，4°C靜置lOmin。12000g，4°C離心lOmin。
[0019](7)小心去掉上清液(先傾倒出液體，再使用200 μ L的槍頭將剩余的異丙醇吸掉，在吸取異丙醇的時候一定不要觸及底部的RNA沉淀，寧可剩余一點異丙醇在EP管內)，加入75%的乙醇約1.5mL，(乙醇一定要在_20°C預冷，使用DEPC處理水配制)，盡量吹打3?5次，然后再振蕩器再使用振蕩器震蕩3?5次(每次I?2s，動作不能太劇烈，再輕彈管壁使得RNA懸浮起來。)，7500g，4°C離心5min。
[0020](8)打開離心管蓋，室溫干燥5?1min(打開操作臺上的風扇吹，切不可太干)，干燥完畢后，加入適量的無RNA酶水或者DEPC處理水溶解(一般取50 μ L，反復吹打溶解，清洗EP管底部的位置30?50次左右)，得到總RNA提取原液。
[0021](9)電泳檢測并評估提取總RNA的純度和保存完好程度。
[0022]步驟⑴中所述的單增李斯特菌細胞數量優選17個；
[0023]步驟⑵所述的溶菌酶需要嚴格防止RNA酶的污染，以免對實驗產生干擾；
[0024]步驟(3)中所用TRIZOL試劑優選Life Technologies品牌；
[0025]步驟(5)中所述的離心管需要用DEPC處理；
[0026]步驟(6)中所述的異丙醇需要在_20°C冰箱預冷，預冷時間優選24小時；
[0027]步驟(8)中RNA干燥方式優選風扇干燥，以免是RNA無法溶解；
[0028]步驟(9)中所述的電泳過程中所涉及的所有電泳試劑、器皿都需要用DEPC處理；
[0029]2、氧化石墨烯RNA保護原理探宄
[0030](I)驗證RNA酶能否降解被氧化石墨烯吸附的RNA[0031 ] ①取步驟I中所得總RNA提取物。
[0032]②取IyL氧化石墨稀(lmg/mL)，加入步驟①中所述總RNA提取物，并加入39 μ L無RNA酶的水補足至90 μ L，震蕩混勻，并室溫放置5?15分鐘，使氧化石墨烯充分吸附。所述的氧化石墨稀與總RNA的質量比優選為1: (I?10)。
[0033]③向上述混合體系中，加入RNA酶10 μ L，充分混勻，并37 °C孵育30分鐘，得反應液。
[0034]④配制I %的瓊脂糖凝膠，冷卻備用。
[0035]⑤取出步驟③中反應液8 μ L，加入10 X RNA熒光染料(SYBR Gold) 2 μ L，混勻并染色lOmin。然后，再加入電泳載樣緩沖液(Loading Buffer，6X) 2 μ L，并劇烈震蕩。最終得到用于電泳分析的混合液。
[0036]⑥取步驟④中預先制備好的瓊脂糖凝膠，用于步驟⑤所述混合液的電泳分析(電壓:120V,45min)。
[0037]⑦凝膠成像，并觀察記錄實驗結果。通過電泳結果驗證石墨烯吸附的RNA是否穩定存在即可驗證該原理是否成立。
[0038]步驟①中所述的總RNA提取物，在使用之前需要用吸收光譜儀定量，以確保后續實驗的順利展開。一般地，該提取物中RNA原液的量為100 μ g/mL左右。
[0039]步驟②中所述的氧化石墨烯優選南京先豐納米材料科技有限公司產品。
[0040]步驟③中所述的RNA酶優選NEW ENGLAND B1Labs產品。
[0041]步驟⑤中所述的SYBR Gold優選Life Technologi