微桿菌(Microbacterium sp.)J-1在降解多種鄰苯二甲酸酯中的應用
【專利說明】微桿菌(M i crobacter i um sp.) J-1在降解多種鄰苯二甲酸酯中的應用
技術領域
[0001]本發明屬于環境污染物生物處理技術領域，具體地，涉及微桿菌(Mi crobac teri a?sp.) J-1在降解多種鄰苯二甲酸醋中的應用。
【背景技術】
[0002]眾多研宄表明，鄰苯二甲酸醋類化合物(Phthalic acid ester，PAEs)具有高毒性，致畸性、致癌性和致突變性，以及生殖毒性。PAEs主要被用作塑料工業的增塑劑，目前已成為全球最普遍的污染物之一，被美國環境保護局(EPA)和中國環境監測總站列為優先控制污染物(pr1rity pollutant)。根據美國國家癌癥研宄所的研宄結果，其中鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等6種鄰苯二甲酸酯被美國EPA列為優先控制污染物。由于塑料制品的大量使用，PAEs廣泛存在于大氣、水體、土壤以及生物體中。由于PAEs是一類疏水性有機污染物，具有較高的辛醇-水分配系數(Kow)，容易吸附于沉積物和土壤顆粒物上。目前我國農業土壤中PAEs化合物的含量一般在幾yg/kg至幾十mg/kg。已有的調查數據顯示，我國農業土壤中PAEs化合物有不同程度的超標，部分土壤的個別PAEs化合物超標嚴重，因此PAEs污染土壤的修復問題亟待解決。
[0003]環境中的PAEs可通過水解、光解和生物降解而消失，其中生物降解是其消失的主要途徑。近年來，PAEs的細菌降解已經得到廣泛的研宄，大量高效降解PAEs的菌株已經從各類環境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性污泥等。然而，大多數已報道的降解菌均是僅對一種鄰苯二甲酸酯具有高效降解能力，而既能夠高效降解簡單的短鏈PAEs又能降解復雜的支鏈或長鏈PAEs的降解菌種質資源很少被發現。同時，關于微桿菌對PAEs污染土壤的修復效果尚無報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是針對當前多種PAEs污染修復技術的不足，提供微桿菌(Mi crobac teri a?sp.) J-1在降解多種鄰苯二甲酸醋中的應用。
[0005]本發明的技術方案是通過以下技術實現:
提供一種新的可同時高效降解多種PAEs的降解菌，為微桿菌(#icrc^aci6?riwfflsp.)菌株J-1，于2015年I月22日保藏在中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為 CCTCC NO: M 2015055，分類命名為 #icro如Cteri續sp.J-1。
[0006]本發明從污水處理廠的活性污泥中分離出一株對多種PAEs具有高效降解能力的微桿菌，并研宄其在多種PAEs污染土壤中的修復效果，結果表明該菌可有效降低土壤中的PAEs污染，是理想的土壤環境污染修復微生物，具有十分廣泛的應用前景。
[0007]所述微桿菌(Microbactoriuim^.)菌株J-1在LB培養基上培養七天的菌落較小，呈黃白色，濕潤，凸起，有光澤，邊緣整齊。掃描電鏡下多為球狀或近球狀，直徑0.4~1 μπι。
[0008]所述微桿菌iMicrobacteriums'^.')菌株 J-1 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:1所示。通過NCBI官方網站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序與其他已登錄細菌菌株16S rDNA序列進行比對，結果表明該菌株與#icrc^ac?6?ri?? sp.相似性最高，同源率達99%。
[0009]所述微桿菌(JlicrobacteriumiK )菌株J-1能降解多種PAEs，特別是對短鏈PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分別達到78.92%和71.57%，5天的降解率則達到93.42%和87.02%，7天幾乎全部降解(降解率多98%)。而針對長鏈PAEs，雖然相比短鏈PAEs降解速度較慢，但隨著培養時間的延長，仍能達到較好的降解效果。7天DBP、DOP和DEHP的降解率分別達到95.07%,91.11%和84.61%。
[0010]微桿菌QMicrobacteriumv.)菌株 J-1 在降解 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP 中的應用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC NO: M 2015055。
[0011]微桿菌(#icroAaci6?ritt?sp.)菌株J-1在降解DMP和/或DEP中的應用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO:M 2015055。
[0012]微桿菌QMicrobacteriumv.)菌株 J-1 在修復 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP 污染介質中的應用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC NO: M 2015055。
[0013]優選地，所述介質為土壤、水或空氣。
[0014]微桿菌QMicrobacteriumv.)菌株 J-1 在制備降解 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP的生物制劑中的應用，所述生物制劑包括菌株J-1的菌懸液和其他輔劑。
[0015]優選地，所述菌懸液的OD600 ? = 0.8~1.2?
[0016]更優選地，所述菌懸液的OD6qq M = 1.0o
[0017]優選地，所述菌懸液的制備方法為將純化后的菌株J-1接入常規微生物液體培養基培養至對數期，離心收集菌體，用PBS洗菌后重懸調節0D_ ? = 0.8-1.2作為菌懸液。
[0018]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
本發明從污水處理廠的活性污泥中首次分離出一株對多種PAEs具有高效降解能力的微桿菌，該菌株能降解多種PAEs，特別是對短鏈PAEs。本發明提供的降解菌彌補了菌種資源庫中一菌多效菌種資源的不足；而且該菌在自然界中分布廣泛，適應能力強。同時本發明提供了該菌株在修復污染土壤中的應用研宄，為PAEs 土壤污染的生物處理提供了技術保障。
【附圖說明】
[0019]圖1為J-1菌株在LB培養基上培養7天的生長形態特征。
[0020]圖2為J-1菌株的掃描電鏡照片。
[0021]圖3為J-1菌株的16S rDNA的系統發育樹。
[0022]圖4為J-1菌株對五種混合PAEs的降解效果。
[0023]圖5為未接菌的污染土壤處理中各PAEs的降解效果。
[0024]圖6為J-1菌株對污染土壤處理中各PAEs的降解效果。
【具體實施方式】
[0025]下面結合說明書附圖和具體實施例來進一步詳細闡述本發明。本發明以下實施例為本發明較佳的實施方式，本發明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應用思想，實施方式中簡單參數的替換不能一一在實施例中贅述，但并不因此限制本發明的保護范圍，其他任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應被視為等效的置換方式，包含在本發明的保護范圍之內。
[0026]實施例中所述培養基配方如下:
無機鹽培養液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，FeCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最終 pH 為 7.5。
[0027]牛肉膏蛋白胨培養基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，加超純水至1L，調節pH= 7.0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加1.5% (w/v)瓊脂粉。
[0028]實施例1菌株的分離與鑒定
采集污水處理廠的活性污泥，稱取5 g活性污泥樣品于含有50 mL無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培養3天后，取5 mL污泥懸液加入含有100 mL PAEs (分別含50mg/L DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP )的上述MSM培養基中。經30 °C，140 rpm培養7天后，每次按取I mL的接種量連續富集、轉接10次，并相應提高培養基中PAEs含量至800 mg/L。然后將馴化10次的培養液稀釋103~105涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養1~3天。待平板上長出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細菌，編號J-1。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養7天，觀察其菌落形態(見圖1)。由圖1可知，J-1菌株在LB培養基上培養七天的菌落較小，呈黃白色，濕潤，凸起，有光澤，邊緣整齊。
[0029]掃描電鏡觀察鑒定:將純化后的J-1菌株接入含有10 mL的LB液體培養基過夜活化。吸取800 μ L菌液經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入I mL 2.5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然后再次經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。隨后將菌體分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個