一株表達植酸酶的釀酒酵母工程菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株釀酒酵母工程菌及其應用，特別是一株在細胞表面錨定表達植酸酶的釀酒酵母菌株及其應用。
【背景技術】
[0002]燃料酒精是一種可再生的清潔能源，國內外生產燃料酒精的原料有玉米、甘薯、木薯、甘蔗、甜菜、高粱秸桿等，目前應用于工業生產的主要是玉米類淀粉質原料。酒精糟液的處理是燃料酒精生產中的一個關鍵工序，糟液中含有糖分，蛋白質，纖維素，氨，磷，鉀等營養成分，經濃縮處理后可用于生產動物飼料。酒精糟液中的磷主要以植酸磷的形式存在，植酸磷是一種抗營養因子，不能被動物直接吸收利用，還會影響其他礦物元素的吸收，同時，植酸磷隨動物糞便排出體外后，會對環境造成污染。
[0003]植酸酶能夠催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)，同時釋放出與植酸(鹽)結合的其它營養物質。在酒精發酵生產中，有通過外源添加植酸酶以提高酒精生產效率，降低酒糟中的植酸磷含量的研宄，但是要從根本上解決植酸磷酒精發酵及酒糟利用的不利影響，還是需要利用基因工程的手段構建能夠分泌表達植酸酶的釀酒酵母菌株。
【發明內容】
[0004]本發明提供了一株表達植酸酶的釀酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy，已于2015年4月2日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學校內(武漢大學第一附小對面)武漢大學保藏中心，保藏編號CCTCC M 2015190。
[0005]本發明提供的釀酒酵母工程菌，是將植酸酶的編碼基因Phy和α -凝集素的編碼基因AG α I融合后導入釀酒酵母CICMY0086 (江南大學中國高校工業微生物資源與信息中心保藏)中，得到的在細胞表面錨定表達植酸酶的菌株。
[0006]所述植酸酶的氨基酸序列的GenBank號為ΝΡ_415500 ;所述α -凝集素的GenBank號為 ΑΑΑ34417。
[0007]所述植酸酶的編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為946206 ;所述α -凝集素的編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為Μ28164。
[0008]所述植酸酶的編碼基因phy通過表達載體pMGK-AG導入釀酒酵母；所述表達載體PMGK-AG包含有α -凝集素編碼基因的核苷酸序列。
[0009]所述釀酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PHY0
[0010]釀酒酵母PHY由以下步驟獲得:
[0011](I)構建重組質粒pMGK-AG-phy，流程如圖4所示。以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，PCR擴增得到植酸酶基因phy片段；將擴增得到的phy基因與質粒pPIC9k連接，得到重組質粒pPIC9k-phy，以此為模板PCR擴增得到含信號肽的sphy基因，與表面展示載體pMGK-AG(江南大學中國高校工業微生物資源與信息中心保藏)連接，得到重組載體pMGK-AG-phy。
[0012](2)將重組載體pMGK-AG-phy轉化釀酒酵母CICMY0086，獲得重組酵母PHY
[0013]釀酒酵母PHY的細胞為橢圓形，菌落形態特征是菌落凸起、光滑、乳白色、邊緣整齊；最適生長溫度30 °C，最適生長pH為5.5。
[0014]釀酒酵母PHY的植酸酶酶活為6.4U/g(菌體濕重)，酶活測定采用鉬藍法，具體操作:將800 μ L 6.25mmol/L的植酸鈉溶液37°C預熱lOmin，加入200 μ L上清液或全細胞催化劑，37°C反應30min，立即加入ImL 5%的三氯乙酸終止反應，加入ImL顯色液(1.5%鉬酸銨溶液，2.7%硫酸亞鐵，4:1比例混合，現用現配)，室溫下靜置10min，8000r/min離心5min，測定其在700nm處的吸光值。酶活定義為:在37°C、pH 5.0條件下，每分鐘從5.0mmol/L植酸鈉溶液中釋放出I μπιο?的無機磷所需的酶量定義為I個酶活力單位。
[0015]本發明還提供了一種利用上述釀酒酵母工程菌生產酒精的應用。
[0016]本發明提供的生產酒精的應用是以玉米粉/木薯培養基為發酵培養基，配制方法為:按l:3(w/v)的比例將玉米粉/木薯粉與去離子水混合，調pH至6.0，加入耐高溫α淀粉酶(10U/g)，加熱料液至95°C，維持2h，降至室溫后調pH至4.5，添加去離子水以彌補水分損失，高壓蒸汽滅菌，降溫后加入糖化酶(130U/g)和尿素(終濃度0.05% )。
[0017]本發明所提供的釀酒酵母工程菌，在以玉米粉/木薯粉為原料的同步糖化發酵實驗表明，生長速度高于出發菌株，同時酒精產量相較出發菌株提高了 5.6%。更為重要的是發酵后酒糟中植酸磷含量與對照相比降低了 91 %。構建的表面展示表達植酸酶的重組工業釀酒酵母能夠有效降低植酸含量，提高了酒糟的利用價值，減少磷排放，對燃料酒精的環境友好生產具有重要的意義。
【附圖說明】
:
[0018]圖1為植酸酶基因PCR產物和重組質粒pPIC9k_phy酶切產物電泳圖
[0019]圖2為帶信號肽的植酸酶基因PCR產物和重組質粒pMGK-AG-phy酶切產物電泳圖
[0020]圖3為釀酒酵母轉化子的染色體DNA的PCR產物電泳圖[0021 ] 圖4為重組質粒pMGK-AG-phy的構建流程圖
[0022]圖5為釀酒酵母工程菌PHY發酵過程中的葡萄糖和酒精變化圖
[0023]圖6為釀酒酵母工程菌PHY發酵的過程中，培養基干物質中的植酸磷含量變化曲線
【具體實施方式】
:
[0024]下述實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0025]實施1、構建釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)PHY。
[0026]一、含有植酸酶編碼基因的重組質粒pPIC9K_phy的構建
[0027]根據已報道的大腸桿菌植酸酶的編碼基因phy的核苷酸序列(phy基因序列的GenBank號為946206)，設計如下引物，在下游引物中引入EcoR I酶切位點(用下劃線標出)。
[0028]上游引物Phyl:ATGAAAGCGATCTTAATCCCAT
[0029]下游引物Phy2: CCGGAATTCTTACAAACTGCACGCCGGTA
[0030]以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以Phyl、Phy2為引物，進行PCR擴增。將得到的PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示，得到一條約1300bp的特異性條帶，其大小與GenBank已公布的基因長度一致，經進一步DNA測序表明擴增得到植酸酶基因。將擴增得到的Phy基因用Pfu補平后與SnaB I酶切后的質粒pPIC9k(江南大學中國高校工業微生物資源與信息中心保藏)連接，構建了重組質粒pPIC9k-phy。利用限制性內切酶Sal I進行酶切驗證，結果見圖1，酶切得到大小約3000bp和7500bp的帶，與預期相當，酶切驗證結果證明pPIC9k_phy的結構正確。圖1中，泳道M為DL 15000DNA Marker，泳道I為Phy的PCR產物，泳道2為SnaB I酶切后的質粒pPIC9k，泳道3為Sal I酶切后的重組質粒pPIC9k_phy。
[0031]二、含有植酸酶編碼基因的重組質粒pMGK-AG-phy的構建
[0032]根據pPIC9K中的alpha因子信號肽的核苷酸序列設計上游引物pl，引入EcoR I酶切位點，Pi核苷酸序列如下
[0033]上游引物P1: CCGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAA
[0034]以重組質粒pPIC9k_phy為模板，以pl和Phy2為上下游引物，進行PCR擴增。將得到的PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖2所示，得到一條約1500bp的特異性條帶，其大小與預期相同，表明擴增得到含信號肽植酸酶基因sphy。將PCR產物用EcoR I酶切后用核酸酶SI處理得到平末端片段，同樣方法處理表面展示載體pMGK-AG (江南大學中國高校工業微生物資源與信息中心保藏)，T4連接酶16°C過夜連接，構建表達載體pMGK-AG-phy。利用限制性內切酶Hind III進行酶切驗證，結果見圖2，酶切得到大小約1000bp、4000bp和6000bp的帶，與預期相當，酶切驗證結果證明pMGK-AG-phy的結構正確。圖2中，泳道M為DL 15000DNA Marker，泳道I為sphy的PCR產物，泳道2為EcoR I酶切后用核酸酶SI處理的質粒pMGK-AG，泳道3為Hind III酶切后的重組質粒pMGK-AG-phy。
[0035]重組質粒pMGK-AG-phy的構建流程如圖4所示。
[0036]三、重組質粒pMGK-AG-phy轉化釀酒酵母CICMY0086
[0037]將重組質粒pMGK-AG