兔抗IgY抗體的制備方法、酶標記抗體的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥生物技術領域，特別是涉及兔抗IgY抗體（IgG)的制備方法、酶標 記抗體IgG-HRP的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] IgY理化性質：禽類的免疫系統包括細胞免疫和體液免疫系統，分別受胸腺和法 氏囊的控制。當機體受到外來抗原刺激后，法氏囊內的B細胞分化成為漿細胞，分泌特異 性抗體進入血液循環，當血液流經卵巢時，特異性抗體（主要是IgG，IgG的英文全稱為 immunoglobulin G，是血清中免疫球蛋白主成分，約占血清中免疫球蛋白總含量的75% ) 在卵細胞中逐漸蓄積，形成卵黃抗體（英文全稱yolk antibody，英文簡稱IgY)，IgY的理化 性質與哺乳動物的IgG相似。IgY與一般哺乳動物IgG相比，IgY具有較強的耐熱、耐酸、抗 離子強度和一定的抗酶降解能力。在低于75°C條件下，IgY具有良好的熱穩定性。IgY制 劑在4°C貯存5年或在室溫貯存6個月其活性仍無明顯變化或下降。IgY對胃蛋白酶有較 高的抵抗力，但對胰蛋白酶十分敏感。將胃蛋白酶和IgY在PH2.0溫育Ih后，幾乎所有活 性喪失，但在pH4. 0時Ih后可保持91 %的活性，甚至溫育IOh后仍有63%活性。IgY分別 與胰蛋白酶和胰凝乳酶溫育8h，活性分別保持39%和41%。
[0003] IgY在動物疾病防治方面的應用：研宄表明，IgY能抵抗幼齡動物腸道中胰蛋白酶 和胰凝乳蛋白酶的消化。故常在幼畜飼料或添加劑中加入一定量的針對某些特定疾病的 IgY，以使其獲得有效的被動免疫。何月英等利用小鵝瘟強毒制備的卵黃抗體，對2-3日齡 雛鵝進行預防，其保護率高達100%。楊曉梅等用鴨病毒性肝炎I型雞胚毒免疫雞，制備的 雞抗鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體，經實際應用于預防時，雛鴨的平均成活率為96. 9%。卵黃 抗體己被廣泛應用于許多疾病的防治。汪銘書應用抗鴨病毒性肝炎（DHV)的卵黃抗體治療 人工感染的鴨時，當用1萬倍LD50強毒時保護率可達到100%。張英等用抗小鵝瘟的卵黃 抗體治療發病鵝群，治愈率為95. 2%。此外，應用多種病原菌免疫制備的卵黃抗體還可以 防治多種病原菌的感染。詹麗娥等用IBD、ND和EDS-76三聯高免卵黃抗體治療上述三種疾 病，總有效率可達50%以上。日本成功地從雞蛋中提取出能夠殺死幽門螺旋桿菌的抗體，并 以這種抗體為原料制成了能殺死人體內幽門螺旋桿菌的酸奶。卵黃抗體治療疾病，安全、高 效且無公害，我國已有部分商品化的卵黃抗體供應。
[0004] IgY在動物疾病診斷方面的應用：卵黃抗體和哺乳動物免疫球蛋白有許多不同之 處，如它不與金色葡萄球菌A蛋白結合，不與哺乳動物Fc受體結合，對哺乳動物補體無固定 作用等，這使得卵黃抗體在檢測診斷上具有更強的特異性和靈敏度，所以卵黃抗體可以應 用于免疫熒光試驗、ELISA試驗、免疫擴散、免疫電泳等。鄭厚旌等用卵黃瓊擴實驗檢驗卵 黃中的IBD抗體水平，結果表明用卵黃瓊擴試驗替代血清瓊擴試驗檢測IBD抗體水平是可 行的，并且具有經濟、省力、省時的特點。此外卵黃抗體有望取代傳統的多克隆抗體的生產， 獲取大量更有效的抗體，同時也可減少對動物的副反應，提高動物的福利。
[0005] IgY開發前景：IgY作為替代抗生素的新型飼料添加劑正在引起人們的關注，IgY 取代抗生素用作生長促進劑，不會產生藥物殘留，是一種安全的綠色添加劑。用雞卵黃大量 生產、制備多克隆抗體是近年來抗體制備技術中新興的研宄領域。IgY產量高，價格低廉。 使用IgY技術生產免疫球蛋白，可以減少對動物的應激，提高動物的福利。
[0006] 綜上所述，雞卵黃IgY是一種高產、優質的多克隆抗體，而且雞大規模工業化飼養 成本低，經濟方便，同時制備IgY的工藝相對簡單。因此，IgY在生物制品的開發和疾病的 防治方面具有廣闊的前景。
[0007] 但應用卵黃抗體防治疾病也有不可避免的缺點，如可能帶有蛋傳染性疾病的病 原，對養禽業存在潛在的威脅。因此，對各種IgY抗體（IgG)制品的鑒定、效價檢測就成了 制品應用的基礎。目前，公認的敏感方法是免疫標記技術，但目前沒有"免疫標記的兔抗雞 卵黃抗體"的供應，給鑒定帶來困難。
[0008] 免疫酶技術已廣泛應用于臨床檢測和實驗研宄，其中以酶聯免疫吸附試驗（英文 全稱為enzyme linked immunosorbent assay，英文簡稱為ELISA)最為常用，它既可用于測 定抗體，又可測定可溶性抗原及細胞抗原。
[0009] 酶聯免疫吸附試驗的基本原理：先將已知的抗體或抗原結合在某種固相載體上， 并保持其免疫活性；測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸 附的抗體或抗原發生反應，再用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離成分，然后加入酶 的作用底物催化顯色，進行定性或定量。
【發明內容】
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[0010] 本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種兔抗IgY抗體的制備方法。
[0011] 本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種酶標記抗體的制備方法。
[0012] 上述第一個技術問題通過以下技術方案進行解決：
[0013] 一種兔抗IgY抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0014] (1)硫酸銨鹽析法粗提取IgG :
[0015] (101)取等體積量的兔抗IgY免疫血清和生理鹽水進行混合，邊攪拌邊滴加飽和 硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度為50%，記錄此時飽和硫酸銨的加入量X毫升，X>0,4°C靜 置3h以上，3000rpm離心20min，棄上清液，得沉淀物；
[0016] (102)沉淀物用生理鹽水稀釋至0. 5X毫升，邊攪拌邊滴加飽和硫酸銨，使溶液中 硫酸銨飽和度為33 %，4°C靜置3h以上，3000rpm離心20min，棄上清液，取沉淀物；重復此 步驟2次；
[0017] (103)按每毫克沉淀物加500ul的生理鹽水的比例用生理鹽水溶解（102)所制 得的沉淀物，裝入透析袋，置4°C用0. lmol/L、PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液（PBS)作為透 析處理液進行透析除鹽，更換透析處理液數次直至：奈氏試劑測定無 NH4+，1% BaCl2測定無 304%得所需的IgG樣品，置4°C保存；
[0018] (2)葡聚糖凝膠純化IgG :
[0019] (201)凝膠的預處理；
[0020] (202)裝柱：凝膠床總體積與IgG樣品的加入體積量應滿足：IgG樣品的加入體積 量為凝膠床總體積的5%~10% ;
[0021] (203)加樣：凝膠床經平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時，關閉流 出口，用滴管加入樣品，打開流出口，使樣品緩慢滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表 面持平時，用洗脫液沖洗管壁；
[0022] (204)洗脫與收集：洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統，調節洗脫液流速為每分 鐘1毫升，進行洗脫，收集洗脫液中與目的峰相應的部分洗脫液作為所需的兔抗IgY抗體。
[0023] 本發明的兔抗IgY抗體的制備方法，操作簡單，可以制備出兔抗IgY抗體，為酶標 記抗體IgG-HRP的制備提供了基礎。
[0024] 進一步的方案是，所述步驟（101)中兔抗IgY免疫血清的制備方法，包括以下步 驟：
[0025] (111) IgY制備：取雞蛋卵黃并加入8倍體積的滅菌的雙蒸水，用濃度為 0.1 M的HCl溶液調PH為5. 0-5. 1，置4 °C攪拌8h，得卵黃稀釋液；取卵黃稀釋液，以 10000_12000rpm、4°C進行離心15min，收取上清液；于上清液中加入使用0. 01mol/L、PH7. 4 的PBS液配制的濃度為8 %的PEG6000量，雞蛋卵黃量/濃度為8 %的PEG6000量=5g/ml， 攪拌30min，以10000-12000rpm、4°C進行離心10min，收集沉淀，去上清液；將沉淀物溶于 0· 01mol/L、pH7. 4的PBS液并裝入透析袋中，在0· 01mol/L、PH值為7. 4的PBS透析液中透 析，每毫克沉淀物對應500 μ 1的PBS液、500ml的透析液，透析完成后用0. 22 μ m膜過濾除 菌，取蛋白質濃度大于30mg蛋白/ml的產物作為所需的IgY，置-20°C保存；
[0026] (112) IgY免疫原制備：將所制備的IgY進行調整以至蛋白質濃度30mg蛋白/ml， 將IOml弗氏完全佐劑置于研缽內，邊研磨邊滴加等量所調整后的IgY，直至形成白色油包 水乳劑，置4°C保存備用；
[0027] (113)免疫家兔：選用2~2. 5kg健康家兔，于頸后，兩后肢大腿外側共四個部 位皮下各注射步驟（112)所得物0. 5ml，7天后再次同樣免疫，21天后同樣部位注射步驟 (111)所得物〇. 5ml，末次注射后第7天試血，雙向瓊脂擴散試驗效價達1 : 16~1 : 32 放血收集血清，得兔抗IgY免疫血清。
[0028] 上述方案具體了兔抗IgY免疫血清的制備方法，方法簡單實用，容易推廣。
[0029] 上述第二個技術問題通過以下技術方案進行解決：
[0030] 一種酶標記抗體IgG-HRP的制備方法，使用上述一種兔抗IgY抗體制備，包括如下