胸腺肽的制備提取方法及其用藥安全的產物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于多肽/蛋白質技術領域，具體而言，本發明涉及胸腺肽的提取方法，其改進了現有的提取方法，所獲得的胸腺肽產物更加安全，減少了用藥的不良反應的發生。
【背景技術】
[0002]胸腺是人體的重要免疫器官，其能分泌多種重要的激素，如促胸腺生成素、胸腺肽等。其中，胸腺肽(又名胸腺素，thymosin)是胸腺組織分泌的具有生理活性的一組多肽(組合物)，可以從牛、豬的胸腺里面提取得到，例如，可通過本發明人早期發明的提取方法來提取(參見中國專利第02117757號)。然而，提取的胸腺肽成份復雜，盡管各種肽成份可以起到協同作用或補償作用，功效更能得到保證，但是發生不良反應的潛在可能性也更大。
[0003]為此，近10年來，人們主要通過基因工程手段來獲得成份單一的胸腺肽(化合物)，例如α-胸腺肽、胸腺五肽或它們的衍生物等。通過提取方法獲得胸腺肽(組合物)的思路已經逐漸邊緣化了，連進行相應研宄的興趣也基本沒有了。
[0004]甚至實際上本發明人也沒有免俗，中國專利第02117757號后再開發的技術也基本涉及通過基因工程手段來獲得成份單一的胸腺肽(化合物)。然而，本發明人并沒有完全受現有技術發展趨勢的左右，在長期嚴謹的實踐所不懈積累的數據中偶然發現了一些與提取的胸腺肽的不良反應發生有關聯的端倪，經過艱苦的研宄，在提取的胸腺肽的眾多成份中發現了一種會增加不良反應發生率的成份，因而摸索出了新的胸腺肽的提取方法，使通過其提取的胸腺肽能大幅降低不良反應發生率，在當前公眾和藥監部門日益重視藥品安全性的情況下，是十分有益的。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題在于提供新的胸腺肽的提取方法。另外，本發明還提供了通過該方法提取的胸腺肽及其應用等。
[0006]具體而言，在第一方面，本發明提供了制備胸腺肽的方法，其特征在于，其包括以下步驟:
[0007](I)對新鮮的胸腺加入ρΗ2.0-4.0的緩沖溶液，以抑制酶活性；
[0008](2)對胸腺組織緩沖溶液進行處理以破碎細胞(優選在10°C以下用超聲波、勻質機或超細技術進行處理)；
[0009](3)任選在5-15分鐘內將破碎細胞提取的產物用微波加熱至70_85°C (優選80°C )并然后迅速冷卻(優選冷卻至10°C以下);
[0010](4)冷凍離心得離心液，經截留分子量為6000-10000的超濾柱進行超濾；
[0011](5)應用納濾技術，將超濾液濃縮(優選濃縮5-15倍)，得濃縮產物；和，
[0012](6)檢測并保留不含峰2所對應的成份的濃縮產物，其中，峰2是HPLC圖譜上47-49min處(優選約47.8min處，如47.8min處)的峰。
[0013]在本文中，胸腺肽也稱提取的胸腺肽，指的是從動物中提取的天然胸腺肽，其通常是從動物(如豬、牛、羊等哺乳動物)的胸腺提取的。優選在本發明第一方面的方法中，胸腺是牛胸腺(如，小牛胸腺、胎牛胸腺)、羊胸腺和/或豬胸腺。
[0014]通過精細的純化過程，可以直接去除濃縮產物中的峰2所對應的成份，然而優選在本發明第一方面的方法中，檢測是取樣并進行HPLC檢測，然后再保留不含峰2所對應的成份的濃縮產物的批次。
[0015]在本發明的【具體實施方式】中，HPLC檢測的條件是以磷酸鹽溶液為流動相，以每分鐘0.6ml的流速，以色氨酸為內標，并且以260nm波長為檢測波長。
[0016]另外，本發明第一方面的方法可以包括棄去含峰2所對應的成份的濃縮產物的步驟。
[0017]在第二方面，本發明提供了提取的胸腺肽，其不含峰2所對應的成份的濃縮產物，其中，峰2是HPLC圖譜上47-49min處(優選約47.8min處)的峰。經本發明人研宄發現，峰2所對應的成份會帶來潛在的注射用藥安全性隱患，盡管仍舊達到目前的用藥標準，但是如果去掉，將有益于公眾的用藥安全，減少醫療糾紛，是值得推廣的。
[0018]優選本發明第二方面的胸腺肽是通過本發明第一方面的方法制備的。
[0019]在第三方面，本發明提供了一種藥物制劑，其包括本發明第二方面的胸腺肽和藥學上可接受的輔劑。藥學上可接受的輔劑包括藥學上可接受的各種輔料、載體，有賦形劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、酶抑制劑、崩解劑、潤滑劑、潤濕劑和/或粘合劑等，它們與活性成分相容。通過藥學教科書或試驗手冊，運用藥學上可接受的輔劑制備常規的藥物制劑對本領域普通技術人員來說是熟知的。本發明的藥物制劑包含本發明第二方面的胸腺肽作為活性成分，將該胸腺肽和藥學上可接受的輔劑組合在一起，配制成各種制劑，優選為固體制劑和液體制劑。本發明的制劑可以為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑、粉針劑(包括凍干粉針劑)、等劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥形式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等的給藥形式。本發明優選的是注射劑，包括注射液或注射用凍干粉。例如，可以選用生理鹽水與第二方面的胸腺肽配制成注射液。
[0020]在第四方面，本發明提供了本發明第二方面所述的胸腺肽在制備用于慢性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、原發性或繼發性T淋巴細胞缺陷病、自身免疫性疾病、細胞免疫功能低下相關的疾病或腫瘤性疾病輔助性治療的藥物中的應用。給藥的劑量和形式一般由醫師根據患者的具體情況(如年齡、體重、性別、患病時間、身體狀況等)確定。如以注射劑形式給藥，以藥物中的胸腺肽計，給藥的劑量為l-50mg胸腺肽/每名成人患者。給藥形式根據各種藥物制劑的劑型來確定，適合的給藥形式有口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等給藥形式，本發明優選注射的給藥形式。
[0021]在第五方面，本發明提供了檢測本發明第二方面所述的胸腺肽的方法，其包括將待測的胸腺肽進行HPLC檢測并判斷HPLC圖譜上是否存在47-49min處(優選約47.8min處)的峰，其中HPLC檢測的條件是以磷酸鹽溶液為流動相，以每分鐘0.6ml的流速，以色氨酸為內標，并且以260nm波長為檢測波長。該方法能夠在取樣量很少的情況下，快速檢測出待測的胸腺肽是否是本發明第二方面所述的胸腺肽，從而可以判斷待測的胸腺肽所屬批次的胸腺肽是否是本發明第二方面所述的胸腺肽。
[0022]本發明取得的有益效果在于:進一步提高了胸腺肽用藥的安全性，在當前公眾和藥監部門日益重視藥品安全性的情況下，是特別值得推廣的；對原有的(提取)制備方法的改動小，增加的制備時間和設備少，還可以沿用原有生產設備。
[0023]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多修改對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。
[0024]另外，本發明引用了現有公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文之中，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。
【附圖說明】
[0025]圖1顯示了本發明提取的合格胸腺肽的示例性的HPLC圖譜，其是由多批次合格的胸腺肽的HPLC圖譜重疊而成的。為了保持可見性，疊加在后的曲線做了一定的坐標偏移，但是在各自的峰2位置上沒有可檢測的峰。其中，從圖上左側開始由下至上依次為批次I