鑒別PRV強毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于動物疫病檢疫檢測技術領域，具體的，涉及鑒別PRV強毒和PRV gG基 因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物。
【背景技術】
[0002] 偽狂犬（Pseudorabies，PR)是世界范圍內廣泛發生的一種豬的急性、高度接觸性 傳染病。該病傳染性強，易繼發細菌和其他病毒的混合感染或繼發感染，主要以新生仔豬的 急性死亡及4周齡以上仔豬出現神經癥狀，妊娠母豬以繁殖障礙、流產、死胎及呼吸道癥狀 為特征。近年來，尤其是2012年，PR在我國相繼發生，在23個以上省內流行，出現高發病 率和死亡率，新生及4周齡以內的仔豬突然發病，死亡率可高達100%等新的發病特點。該 病無特效藥物治療，成為危害養豬業的主要疫病之一。
[0003] PR病原為偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)，屬于痕疼病毒科a痕疼病毒 亞科水痘病毒屬的豬皰瘆病毒I型，基因組全長為150kbp。目前已在PRV中發現了 11種糖 蛋白，分別命名為gB、gC、gD、gE、gG、gH、gj、gK、gL、gM和gN。其中gD基因編碼的gD蛋白 與gl蛋白形成復合體，參與病毒的吸附過程，是重要的免疫原性蛋白。gG基因是PRV中的 一個分泌性的非必需糖蛋白基因。gE基因編碼的gE蛋白是一種促進細胞融合的糖蛋白，介 導病毒從細胞到細胞之間的擴散。影響PRV在豬體內的組織趨向性，是經三叉神經節侵入 中樞神經組織所必需的。
[0004] 目前，國內外使用最廣的PRV基因缺失疫苗是gE基因缺失疫苗。美國使用gE、gG 和gC基因缺失疫苗。但在日本多使用gG基因缺失疫苗，我國生產的以鄂A株為親本毒株 構建的T K7gG_/LacZ+基因缺失疫苗高安全性，免疫效果優于國外同類產品，在國內也廣泛 應用。
[0005] 現已有的PRV診斷方法主要是針對全病毒抗體或gE抗體缺失的血清學ELISA診 斷方法，這些方法存在操作繁瑣、技術要求和試驗條件要求高、試驗周期長等缺點，難以滿 足快速、大量鑒別檢測的需要，目前PCR檢測方法針對PRV的單一基因的判斷，無法滿足快 速鑒別檢測PRV強毒和PRV gG和PRV gE基因缺失疫苗毒的需要。因此建立一種快速、高 效、特異、敏感的檢測方法，從而能同時對PRV強毒、PRV gG和PRV gE基因缺失疫苗毒進行 快速鑒別檢測，對于PR的快速確診具有重要意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種可快速鑒別檢測PRV強毒、PRV gG基因缺失疫苗毒以及 PRV gE基因缺失疫苗毒的三重PCR檢測引物。
[0007] 本發明的另一目的是提供上述引物在PCR鑒別PRV強毒和PRV gG、PRV gE基因缺 失疫苗毒中的應用。
[0008] 為了實現本發明目的，本發明的發明人經大量比對GenBank中PRV gD、gG、gE基因 序列，選取PRV gD、gG、gE基因高度保守且具有型特異性基因的序列為模板，設計合成PRV gD、gG、gE基因特異性引物對，分別命名為PRV gD-F(Pl)、PRV gD-R(P2)、PRV gG-F(P3)、PRV gG-R(P4)、PRV gE-F(P5)和 PRV gE-R(P6);由此，提供了一種鑒別 PRV 強毒和 PRV gG 基因 缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物，具體的：
[0009] P1 :3' -GGAGGACGAG CTGGG GCTGC-5'（SEQ ID NO :1 所示序列）；
[0010] P2 :3' -CCACGCCCCG CTTGA AGCTG-5'（SEQ ID NO :2 所示序列）；
[0011] P3 :3' -ACACCCGCAC GCGCATCGAC-5'（SEQ ID NO :3 所示序列）；
[0012] P4 :3' -TCTCGGCGGC GGTCACGITC-5'（SEQ ID NO :4 所示序列）；
[0013] P5 :3' -GTCACCGAGG TCCCGAGTCC(SEQ ID NO :5 所示序列）；
[0014] P6 :3' -GCGTGTAGAG GCCCGTGTCG(SEQ ID NO :6 所示序列）。
[0015] 其中，P1和P2用于擴增PRV gD片段，片段長度為212bp。
[0016] P3和P4用于擴增PRV gG片段，片段長度為315bp。
[0017] P5和P6用于擴增PRV gE片段，片段長度為472bp。
[0018] 本發明還提供含有上述引物用于鑒別PRV強毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒 的試劑盒。
[0019] 其中，在本發明所提供的試劑盒中還可以含有陽性對照品和陰性對照品，陽性對 照品可以為滅活的PRV細胞培養物、PRV gE基因缺失疫苗毒以及PRV gG基因缺失疫苗毒。
[0020] 本發明進一步提供上述引物或試劑盒在PCR鑒別PRV強毒和PRV gG、PRV gE基因 缺失疫苗毒中的應用。
[0021] 可選的，所述應用包括以下步驟：
[0022] 1)提取待測樣品總DNA ;
[0023] 2)以提取的待測樣品總DNA為模板，以P1、P2、P3、P4、P5、P6為擴增引物，進行PCR 擴增反應獲得擴增產物；
[0024] 3)對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0025] 可選的，所述待測樣品可以為淋巴結、腦組織或三叉神經節。
[0026] 其中，本發明對提取所述待測樣品總DNA的方法沒有特別的限制，可以采用本領 域常規的總DNA提取方法進行。
[0027] 可選的，進行PCR擴增反應使用的反應體系以25yL計為：Pl、P2、P3、P4、P5、P6 的終濃度各為0.4 4111〇1/1，2\60 81^€61'112.5 1^，5"1^￡1139酶0.251^，豬偽狂犬 病毒DNA 2yL，用去尚子水補至25yL。
[0028] 可選的，？0?擴增反應條件為：94°〇51^11后，941：3〇8,631：3〇8,721：3〇8,35個循 環；72°C 10min。
[0029] 鑒定結果判定：陰性對照未擴增出條帶，陽性對照分別擴增出212bp、315bp和 472bp條帶，為試驗成立，否則試驗不成立；樣品PCR產物中同時出現212bp、315bp和 472bp，表明該樣品為PRV野毒感染樣品；樣品中同時出現212bp、315bp條帶，表明該樣品為 gE/PRV缺失疫苗株陽性；樣品中同時出現212bp、472bp條帶，表明該樣品為gG/PRV缺失疫 苗株陽性；樣品中只出現212bp條帶，表明該樣品為gG/PRV、gE/PRV雙缺失疫苗株陽性；樣 品中未出現任何條帶判為PRV感染陰性。
[0030] 本發明所述的PRV gD/gG/gE三重PCR快速檢測試劑及鑒別檢測方法可實現一個 反應同時對PRV強毒、PRV gG基因缺失疫苗毒和PRV gE基因缺失疫苗毒進行快速鑒別檢 測，可在3h內完成，具有快速、特異、敏感、高通量等優點，能滿足大批量、快速鑒別檢測PRV 強毒和PRV gG基因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的要求。
【附圖說明】
[0031] 圖1為PRV gD/gG/gE三重PCR產物電泳圖。
[0032] 圖中，M. 100bp梯度DNA分子量標記，PL PRV陽性對照，P2. gG基因缺失疫苗毒陽 性對照，P3. gE基因缺失疫苗毒陽性對照，N.陰性對照。
[0033] 圖2為PRV gD/gG/gE三重PCR敏感性試驗
[0034] 圖中，M. 100bp梯度DNA分子量標記，1. PRV gD/gG/gE基因陽性質粒（1. OX 107拷 貝 / y L)，2. PRV gD/gG/gE 基因陽性質粒（1. 0 X 106拷貝 / y L)，3. PRV gD/gG/gE 基因陽性 質粒（1. 0 X 105拷貝 / y L)，4. PRV gD/gG/gE 基因陽性質粒（1. 0 X 10 4拷貝 / y L)，5. PRV gD/gG/gE基因陽性質粒（1. OX 103拷貝 / y L)，6. PRV gD/gG/gE基因（1. 0X 102拷貝 / y L)， 7. PRV gD/gG/gE 基因質粒（1.0X101 拷貝/yL)，8. PRV gD/gG/gE 基因陽性質粒（1.0X10° 拷貝/UL)。
[0035] 圖3為PRV gD/gG/gE三重PCR特異性試驗
[0036] 圖中，M. 100bp梯度DNA分子量標記，PL PRV陽性對照，P2. gG基因缺失疫苗毒陽 性對照，P3. gE基因缺失疫苗毒陽性對照，N.陰性對照，1. LP-PRRSV，2. CSFV，3. PPV，4. JEV， 5. SS2〇
[0037] 圖4為PRV gD/gG/gE三重PCR應用試驗
[0038] 圖中，M. 100bp梯度DNA分子量標記，PL PRV陽性對照，P2. gG基因缺失疫苗毒陽 性對照，P3. gE基因缺失疫苗毒陽性對照，N.陰性對照。其中Pl、4-6、9、12、14、16、20-22、 24、27、31 為 PRV gD/gG/gE 基因檢測陽性，？2、2、7、17、23,32 為？1^80/^基因&6基因缺 失弱毒）檢測陽性、？3，11、13、19、26、29、33、35為？1^ §0/^基因誠基因缺失弱毒）檢 測陽性。
[0039] 圖5為PRV gD PCR方法對35份疑似樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖；
[0040] 圖中，M. DL 2000Marker梯度DNA分子量標記，PL PRV陽性對照，P2. gG基因缺失 疫苗毒陽性對照，P3. gE基因缺失疫苗毒陽性對照，N.陰性對照，其中Pl、P2、P3、3-6、9、 11-14、16、19-22、24-27、29、32、33、35為？1^ 80基因檢測陽性，其余樣品為陰性。
[0041] 圖6為PRV gG PCR方法對35份疑似樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖；
[0042] 圖中，M. 100bp梯度DNA分子量標記，PL PRV陽性對照，P2. gG基因缺失疫苗毒陽 性對照，P3. gE基因缺失疫苗毒陽性對照，N.陰性對照，其中Pl、P2、P3、3-6、9、ll-14、16、 19-22、24-27、29、31、33、35為？1^ §6基因檢測陽性，其余樣品為陰性。
[0043] 圖7為PRV gE PCR方法對35份疑似樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖；
[0044] 圖中，M. 100bp梯度DNA分子量標記，PL PRV陽性對照，P2. gG基因缺失疫苗毒陽 性對照，P3. gE基因缺失疫苗毒陽性對照，N.陰性對照，其中P1、P2、3-8、10、13、15、17-18、 21-25、28、32-33為PRV gE基因檢測陽性，其余樣品為陰性。
【具體實施方式】
[0045] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0046] 實施例1PRV強毒、PRV gG基因缺失疫苗毒以及PRV gE基因缺失疫苗毒的三重PCR 檢測體系的建立
[0047] 1.材料與方法
[0048] 1. 1 材料
[0049] 1. 1. 1 毒株
[0050] PRV分離株由河南省動物疫病預防控制中心實驗室分離鑒定；PRVgE基因缺失疫 苗毒，PRVgG基因缺失疫苗和其他對照病毒或細菌株由河南省動物疫病預防控制中心實驗 室保存。
[0051] 1.1. 2儀器和試劑
[0052] PCR擴增儀，德國Biometra公司產品；凝膠成像分析系統，美國Alpha Innotech公 司產品；恒溫水浴震蕩器（HZQ-?，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司產品；臺式高速冷凍 離心機，美國Heraeus公司產品；Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收試劑盒等均購自寶生 物工程（大連）有限公司，pGEM-T Easy載體、JM109感受態細胞購自Promega公司。
[0053] 1. 2 方法
[0054] 1. 2. 1引物設計和合成<