一種三重rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種三重RT-PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 豬傳染性胃腸炎病毒（PEDV)感染的主要癥狀為嘔吐、帶嚴重惡臭的水樣腹瀉，體 重下降及嚴重脫水。5周齡以上豬死亡率較低，在成年豬上發病溫和，可能出現食欲不振、腹 瀉，哺乳母豬可能出現無乳。但2周齡以下的仔豬最易感染，且發病率與死亡率較高，可能 由饑餓，脫水和酸中毒引發死亡。本試劑盒適用于對豬流行性腹瀉病毒的輔助診斷。
[0003] 豬流行性腹瀉病毒（TGEV)感染的主要癥狀為水樣腹瀉，或者進食后嘔吐；病豬體 溫正常或稍高，精神沉郁，食欲減退或廢絕；斷奶豬、母豬常呈精神萎頓、厭食和持續性腹瀉 大約一周，并逐漸恢復正常，少數豬恢復后生長發育不良；肥育豬在同圈飼養感染后都發生 腹與，一周后康復，死亡率1%-3%。
[0004] 豬A群輪狀病毒（GAR)感染的主要癥狀為急性腹瀉，仔豬多發，主要表現為精神委 頓、厭食、嘔吐、腹瀉、脫水、體重減輕等臨診癥狀。成年豬與育成豬多為隱性感染，是引起豬 胃腸炎的常見病因。本病最早于1943年在患腹瀉的兒童中發現，1975年首次從豬中分離出 輪狀病毒，目前本病呈世界性流行，輪狀病毒病是一種人畜共患傳染病，能侵害人類和許多 畜禽，不僅感染率高，發病率也相當高，對人類健康和畜牧業危害較大。
[0005] 目前，用于檢測PEDV、TGEV和GAR的常用方法有病毒分離、熒光抗體檢測、免疫組 織化學法、電鏡、ELISA病原檢測法和RT-PCR等。但是，病毒分離耗時耗力且比較困難；熒 光抗體檢測和免疫組織化學法非特異性較高且需要熒光顯微鏡進行觀察；ELISA病原檢測 方法應用比較廣泛，但相較PCR方法過程較為復雜；常規RT-PCR每次只能檢測一種病原且 需要將RNA反轉錄后再次進行PCR，操作繁瑣，容易造成氣溶膠污染。
[0006] 因此本發明設計一種一步法三重RT-PCR檢測試劑盒，簡化操作步驟，只通過一步 PCR就能確定單一感染或混合感染，并能確診感染病毒種類。該試劑盒具有操作簡便、準確、 快速等優點。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種三重RT-PCR檢測試劑盒，能夠快速、準確的做出檢測。
[0008] 本發明為解決上述問題所采取的技術方案是：一種三重RT-PCR檢測試劑盒，該試 劑盒由用于病毒RNA提取的A盒和用于RT-PCR檢測的B盒構成，A盒內設有緩沖液RG 9 mL、緩沖液RF 3 mL、緩沖液RD 8 mL、緩沖液RW 12 mL、RNA洗脫液3 mL、50倍TAE電泳緩 沖液8 mL、染色液10 y L、上樣緩沖液30 y L、Rnase-free吸附柱、收集管10個、離心管10 個和0.2 mL PCR管10個，B盒內設有擴增反應液220 yL、酶系10 yL;所述擴增反應液中包 括用于檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒的PCR引物組，所 述引物組由三組引物序列組成，用于豬流行性腹瀉病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID N0: 1和SEQ ID N0:2;用于豬傳染性胃腸炎病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4;用于豬A群輪狀病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6。
[0009] 所述三重RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟： 步驟一、模板RNA的提取 ① 、在已處理的樣品中加入800 y L緩沖液RG，充分顛倒混勻后在室溫下靜置5min，制 得混合液I，備用； ② 、向混合液I中加入200 y L緩沖液RF，混勻后在溫度為30°C下孵育lOmin，之后放 入溫度為2-8°C，轉速為12000rpm的離心機中離心15min，收集上清液，向上清液中加入 500 y L緩沖液RD，并在溫度為15-30°C下孵育5min，制得混合液II，備用； ③ 、將混合液II轉入套有收集管的Rnase-free吸附柱中，室溫下靜置2min后，放入轉 速為12000rpm的離心機中離心lmin，棄去收集管中液體，再向Rnase-free吸附柱中加入 800 y L的緩沖液RW，室溫下靜置2min后，放入轉速為12000rpm的離心機中離心lmin，棄去 收集管中液體，然后在轉速為12000rpm的離心機中離心2min，以除去殘留的洗滌液，備用； ④ 、將步驟③處理后的Rnase-free吸附柱放入離心管中，向吸附膜中央處滴加50 yL RNA洗脫液，室溫下靜置2min后，放入轉速為12000rpm的離心機中離心lmin，收集上清液 即得模板RNA ; 步驟二、PCR擴增 (1 )、配液：取出擴增反應液，在室溫下溶化并混合均勻，經離心后按每個反應擴增反應 液21. 5 y L、酶系1 y L的比例混合并攪拌均勻，制得反應液，備用； (2) 、加樣：將反應液按22. 5 y L/管分裝到各個PCR反應管中，向各個PCR反應管中分 別加入2. 5 y L樣本、陰性對照液或陽性對照液中的一種，封閉后轉移至核酸擴增區，備用； (3) 、PCR擴增檢測：步驟（2)處理的PCR反應管放入PCR儀中擴增，制得擴增產物，擴增 條件為：升溫48°C lOmin，預變性94°C 2min，變性94°C 10s，退火57°C 30s，延伸72°C 20s，30個循環，繪制溶解曲線72°C 5min ; 步驟三、電泳 向容器中加入瓊脂糖和50倍稀釋的TAE電泳緩沖液，且每克瓊脂糖對應的50倍稀釋 的TAE電泳緩沖液66. 7mL，將裝有瓊脂糖和50倍TAE電泳緩沖液的容器放入微波爐中溶 解，然后向容器中加入5 y L染色液，混合并攪拌均勻后制得瓊脂糖凝膠液，將擴增產物置 于110~120V電壓、50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結果； 步驟四、結果判定 若陰性對照、空白對照的電泳泳道無條帶或無199bp、499bp、330bp的條帶，且陽性對 照在199bp、499bp或330bp任一處有明顯條帶，則檢測結果有效，其中，被檢樣品出現199bp 擴增帶為豬流行性腹瀉病毒陽性，出現499bp擴增帶為豬傳染性胃腸炎病毒陽性，出現 330bp擴增帶為豬A群輪狀病毒陽性，出現2條或3條擴增帶則為對應病毒混合感染，否則 為陰性。
[0010] 有益效果 一、本發明根據PEDV 因、TGEV感因和GAR F 7基因分別設計3對特異性引物， 擴增片段大小為199bp、499bp和333bp，使用者可直接通過電泳結果用肉眼進行判斷。
[0011] 二、本發明的試劑盒特異性強、重復性好、操作方便快捷，一般4~6 h就能確診單 一感染或混合感染，達到診斷和鑒別的雙重目的。
[0012] 三、該試劑盒具有較高的靈敏性，豬流行性腹瀉病毒的最低檢測濃度為4. 3 ng/ y L、豬傳染性胃腸炎病毒的最低檢測濃度為3. 2 ng/ y L、豬A群輪狀病毒的最低檢測濃度 為 6. 1 ng/ y L〇
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發明對PEDV、TGEV和GAR進行的一步法RT-PCR檢測結果； 圖2是本發明對PEDV、TGEV、GAR進行的特異性檢測結果； 圖3是本發明對PEDV、TGEV、GAR進行的可重復性檢測結果； 圖4是本發明對PEDV進行的靈敏性檢測結果； 圖5是本發明對TGEV進行的靈敏性檢測結果； 圖6是本發明對GAR進行的靈敏性檢測結果。
【具體實施方式】
[0014] 一種三重RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒由用于病毒RNA提取的A盒和用于RT-PCR 檢測的B盒構成，A盒內設有緩沖液RG 9 mL、緩沖液RF 3 mL、緩沖液RD 8 mL、緩沖液 R