一種檢測荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測動物胃微生物的方法，特別是一種檢測荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法。
【背景技術】
[0002]高通量測序技術(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(〃Next_generat1n〃sequencing technology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。
[0003]根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種:大規模平行簽名測序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(PolonySequencing)、454 焦磷酸測序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa) sequencing、ABISOLiD sequencing、離子半導體測序(1n semiconductor sequencing)、DNA 納米球測序(DNA nanoball sequencing)等。第一、第二代測序技術測序時間長，測量結果不夠精確，測序通量較低，操作較為復雜。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是要提供一種快速、全面的檢測荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法，幫助人們了解荷斯坦奶牛瘤胃中的微生物種類和數量，尤其是對不可培養的瘤胃微生物有了較全面的認識。
[0005]本發明是按如下技術方案實現的:提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通過測序確定其微生物種類及相對數量；按如下操作步驟制備:
[0006](I)基因組DNA抽提:提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后進行微生物DNA組的提取純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA ;
[0007](2)聚合酶鏈式反應擴增:按指定測序區域，合成帶有條形碼的特異引物；將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用基因組DNA小量試劑盒凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，三氨基甲烷洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；全部樣品按照正式實驗條件進行，每個樣品3個重復；
[0008](3)熒光定量:參照電泳初步定量結果，將PCR產物用熒光計藍色熒光定量系統進行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合；
[0009](4)高通量測序平臺文庫構建，按以下步驟進行:
[0010]①連接“Y”字形接頭；
[0011]②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；
[0012]③利用聚合酶鏈式反應擴增進行文庫模板的富集；
[0013]④氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段；
[0014](5)高通量測序平臺測序，按以下步驟進行:
[0015]①DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；
[0016]②另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋(bridge)”；
[0017]③聚合酶鏈式反應擴增，產生DNA簇；
[0018]④DNA擴增子線性化成為單鏈；
[0019]⑤加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸，每次循環只合成一個堿基；生成“熒光基團”和“終止基團”；
[0020]⑥用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類；
[0021]⑦將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3’端粘性即非平末端，繼續聚合第二個核苷酸；
[0022]⑧統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列；
[0023](6)生物信息分析高通量測序平臺測序得到的首尾讀長首先根據重疊部分關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區分樣品后進行波長轉換器聚類分析和物種分類學分析，基于波長轉換器可以進行物種多樣性指數分析，基于波長轉換器聚類分析結果，可以對波長轉換器進行物種多樣性指數分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構的統計分析；
[0024](7)測序結果:確定荷斯坦奶牛瘤胃所有微生物的種類相對數量。
[0025]有益效果，由于采用了上述方案，結果能夠快速，全面，高效的檢測荷斯坦奶牛瘤胃微生物的種類及數量，以便人們對其瘤胃微生物種類及數量的分析，研宄瘤胃微生物對其攝取營養的吸收消化機制。解決了測序時間長，效率低，結果精確度低，測序結果不全面等問題達到了本發明的目的。
[0026]優點:該方法能夠減少檢測時間，檢測結果精確全面，能夠準確測出荷斯坦奶牛瘤胃中所有微生物的種類及相對數量。
【附圖說明】
:
[0027]圖1是本發明的制備方法流程圖。
[0028]圖2是本發明的六頭荷斯坦奶牛瘤胃屬水平下的微生物的種類及相對數量圖。
[0029]圖3是六頭荷斯坦奶牛瘤胃目水平下的微生物的種類及相對數量圖。
【具體實施方式】
[0030]下面結合實例對本發明進一步描述
[0031]實施例1:本發明的方法為:提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通過測序確定其微生物種類及相對數量；按如下操作步驟制備:
[0032](I)基因組DNA抽提:提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后進行微生物DNA組的提取純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA ;
[0033](2)聚合酶鏈式反應:按指定測序區域，合成帶有條形碼的特異引物；將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用基因組DNA小量試劑盒凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，三氨基甲烷洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；全部樣品按照正式實驗條件進行，每個樣品3個重復；所述的條形碼英文表達barcode ;所述的基因組DNA小量試劑盒英文表達AxyPr印DNA ;所述的三氨基甲烷英文表達TrisJlCl ;所述的聚合酶鏈式反應英文表達 PCR ；
[0034](3)熒光定量:參照電泳初步定量結果，將聚合酶鏈式反應產物用熒光計藍色熒光定量系統進行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合；所述的熒光計的型號為TBS-380，英文表達QuantiFluor?-ST ；
[0035](4)高通量測序平臺文庫構建，按以下步驟進行:
[0036]①連接“Y”字形接頭；
[0037]②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；
[0038]③利用聚合酶鏈式反應擴增進行文庫模板的富集；
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