一種香港海鷗型菌的實時熒光pcr檢測試劑盒及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種PCR檢測試劑盒，特別涉及一種香港海鷗型菌的實時熒光PCR檢 測試劑盒及檢測方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 香港海轉型菌（Laribacter hongkonggensis)為需氧及兼性厭氧，革蘭陰性無芽 孢桿菌，分屬奈瑟氏科。該菌是近20年來醫學界發現的首種可致人腹瀉，甚至嚴重腸胃炎 的新的致病菌，該菌最早見報于2001年，由Yuen等人從一位肝硬化病人的胸腔膿血中分離 出（菌株號HKU1)。可引起社區性胃腸炎和旅行者腹瀉，其臨床表現與沙門菌和空腸彎曲菌 引起的病征相似，多數病人出現水樣腹瀉，偶有血便，目前在香港、中國大陸、日本、瑞士、非 洲及中美洲相繼被發現，淡水魚已被證實為香港海鷗型菌宿主。
[0003] 目前香港海鷗型菌的檢測和鑒定方法采用改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂篩選可疑菌 落，用API 20NE作生化鑒定，并用紙片法進行藥敏實驗作進一步確診。操作步驟復雜，周期 長，不便于快速確診。
[0004] 本發明應用新型TaqMan-MGB探針，建立的香港海鷗型菌實時PCR方法，可用于檢 測和鑒定香港海鷗型菌，為香港海鷗型菌病快速診斷提供科學依據。 (三）
【發明內容】
[0005] 本發明目的是根據香港海鷗型菌16S rDNA基因保守序列設計引物和TaqMan探 針，提供一種檢測香港海鷗型菌的實時熒光PCR試劑盒及檢測方法，可實現對香港海鷗型 菌快速、準確、特異檢測。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種香港海鷗型菌的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括PCR 擴增反應液、陽性對照和陰性對照，所述PCR擴增反應液包括特異性上游引物、特異性下游 引物、熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述陰性對照為香港海 鷗型菌全基因提取物，陰性對照為滅菌蒸餾水，所述特異性上游引物、特異性下游引物和熒 光探針序列如下：
[0008] 上游引物：5' -ACT AGC CGT TGG AGA TT-3'
[0009] 下游引物：5' -GGT CGA CTT CAC GCG TTA GC-3'
[0010] 熒光探針：5' -FAM-CGG TIT CTG GTG GCG C-MGB-3'
[0011] 其中FAM為熒光報告基團，MGB為熒光淬滅基團。
[0012] 本發明關鍵在于特異性引物和熒光探針序列的設計及檢測方法，試劑盒中其他組 成，可按本領域常規進行選擇，該試劑盒可用作香港海鷗型菌的定性檢測，也可加入標準菌 株標準品進行定量檢測。
[0013] 進一步，優選所述PCR擴增反應液中特異性上游引物濃度為0. 24 y mol/L。
[0014] 進一步，優選所述PCR擴增反應液中特異性下游引物濃度為0. 24 ymol/L。
[0015] 進一步，優選所述PCR擴增反應液中熒光探針濃度為0. 32 y mol/L。
[0016] 進一步，優選所述PCR擴增反應液組成為：2XPremix Ex TaqTM12.5yl，50XRox Reference Dye II 0? 5 y 1，10 y mol/L 上游引物 0? 6 y 1，10 y mol/L 下游引物 0? 6 y 1， 20 y mol/L熒光探針溶液0. 4 y 1，待檢樣品DNA提取液2 y 1，再用dH20補足至25 y 1。
[0017] 本發明還涉及一種所述香港海鷗型菌的實時熒光PCR檢測試劑盒的應用，具體所 述的應用按如下步驟進行：
[0018] (1)將待測菌株置沸水浴lOmin，lOOOOrpm離心5min，吸上清，獲得待測樣 品， -40°C保存備用；
[0019] (2)將步驟（1)提取的待測樣品作為模板，利用香港海鷗型菌的實時熒光PCR檢 測試劑盒的PCR擴增反應液進行擴增，95 °C預變性20s，95°C變性10s，57 °C退火40s，40個 循環；于57°C處采集熒光進行熒光檢測，熒光檢測模式選擇FAM熒光，基線和閾值設定：基 線調整取3~15個循環的熒光信號，閾值設定原則以閾值線剛好超過陰性對照（H 20)檢測 熒光曲線的最高點，若待測樣品熒光增長曲線高度超過閾值，并呈良好的對數增長，Ct值小 于或等于35. 0,則判斷為陽性，即樣本中存在香港海鷗型菌；若Ct值大于35. 0或擴增曲 線低于基線，則判斷為陰性；每次試驗均設陰、陽性對照，若陰性對照結果Ct值小于或等于 35. 0,或者是陽性對照結果Ct值大于35. 0或擴增曲線低于基線，則判斷為試劑盒失效。
[0020] 本發明建立了利用TaqMan-MGB熒光定量PCR技術檢測香港海鷗型菌的方法，并經 檢測模擬雙盲食品污染樣本，表明該方法切實可行。由于本方法采用了 PCR擴增技術，使得 細菌的檢測敏感性大大提高，而且由于熒光探針的應用，使得其特異性亦大大提高，降低了 常規PCR擴增的假陽性率。
[0021] 本發明的有益效果主要體現在：靶細菌的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規 PCR擴增的假陽性率；可實現對香港海鷗型菌進行快速、準確、特異檢測。 (四）
【附圖說明】
[0022] 圖1中A為不同濃度香港海鷗型菌菌懸液進行實時熒光PCR擴增的Ct值曲線，曲 線 1-曲線 7 分別表示 3. 6 X 107cfu/ml，3. 6 X 106cfu/ml，3. 6 X 105cfu/ml，3. 6 X 104cfu/ml， 3. 6X 103cfu/ml，3. 6X 102cfu/ml，3. 6X lOcfu/ml濃度的菌懸液；B為標準香港海轉型菌菌 懸液的Ct值與菌濃度的標準曲線，Ct = -3. 538 X LOG (X)+13. 56, X為菌濃度，相關系數（r) 為 0? 999。
[0023] 圖2為熒光定量PCR檢測特異性結果曲線。 (五）
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0025] 實施例1 :特異性引物、焚光探針
[0026] 1、材料：
[0027] Premix Ex Taq TM(2X)購自 TaKaRa 公司，MX3000P 型定量 PCR 儀均為美國 STRATAGNE公司產品。
[0028] 2、引物及探針設計與合成：
[0029] 以香港海轉型菌（Laribacter hongkonggensis) 16S rDNA 基因序列〔Genebank 登錄號：EU697019〕為模板，使用Primer Express?(V3. 0,美國ABI公司）軟件分析 TaqMan-MGB引物和探針位點，從中選擇最佳組合。
[0030] 上游引物：5' -ACT AGC CGT TGG AGA TT-3'
[0031] 下游引物：5，-GGT CGA CTT CAC GCG TTA GC-3，
[0032] 熒光探針：5' -FAM-CGG TIT CTG GTG GCG C-MGB-3'
[0033] 其中FAM(6_Carboxy-Fluorescein)為焚光報告基團，MGB(Minor Groove