嵌合抗原受體雙陰性t細胞的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，具體而言，涉及一種嵌合抗原受體雙陰性T細胞的構建方法，尤其涉及一種嵌合抗原受體⑶3+/⑶4_ /⑶8_雙陰性T細胞的構建方法。
【背景技術】
[0002]嵌合抗原受體T細胞(CAR - T細胞)技術，是利用基因工程和病毒轉染技術給殺傷性T細胞構建一個外源性的嵌合抗原受體，使其可以特異性識別腫瘤標志物，并促進CAR - T細胞增殖、活化，持續性發揮腫瘤殺傷功能的技術。由于其對CD19+急性B淋巴細胞白血病的卓越的臨床試驗結果，已經引起醫學界的廣泛關注，被認為是最有希望治愈腫瘤的療法。
[0003]然而，當前的CAR - T臨床試驗都是從患者自體內分離出T細胞進行CAR — T細胞的制備，這就對患者的T細胞質量提出了很高的要求，臨床應用上對患者的T細胞占PBMC的比例、T細胞增殖和激活能力，以及T細胞的殺傷功能等均有較高的適用性標準。臨床試驗實踐中發現，超過80%的患者的T細胞達不到CAR — T細胞制備的要求，因此大多數患者無法從現行的CAR - T治療中受益。鑒于這一問題，同源異體類CAR - T的制備成為研宄的熱點。
[0004]目前的一個研宄方向是通過基因敲除技術將同源異體來源的T細胞的T細胞受體(TCR)敲除(TCR - KO)后，使其失去MHC限制的特性，然后純化出TCR敲除的T細胞，再進行CAR — T細胞的制備，使之發揮腫瘤殺傷作用而避免引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。但在實際應用中遇到很大的技術瓶頸，主要原因是用于基因敲除技術的CRISPR - Cas9等載體分子量較大，導入T細胞困難、其基因敲除的效率低下。并且，如果使用病毒轉染的方式導入CRISPR - Cas9等載體，又會出現嵌合抗原受體二次病毒轉染的抵制現象，因此TCR —KO -CAR-T細胞得率極低，不能進行大規模制備，應用性差。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術存在的以上問題，提供一種嵌合抗原受體雙陰性T細胞的構建方法，利用⑶3+/⑶4_ /⑶8_雙陰性T(DN T)細胞的抗腫瘤特性和主要組織相容性抗原(MHC)的非限制性，結合已有的嵌合抗原受體技術，構建出一種新型的嵌合抗原受體雙陰性T細胞(CAR — DN — T)。DN — T細胞可從正常人外周血中分離純化，利用我們創建的獨特激活和病毒轉染方式，可高效地使其轉染上特定的嵌合抗原受體，特異性殺傷嵌合抗原受體識別的腫瘤細胞。實驗數據顯示制備的CAR -DN-T細胞不具有MHC限制性，不會引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，可以回輸到其他適應癥患者體內進行同源異體式的嵌合抗原受體T細胞(CAR - T細胞)臨床治療，是一種新型的CAR - T細胞，可以快速進行推廣和產業化。
[0006]為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現:
[0007]一種嵌合抗原受體雙陰性T細胞的構建方法，根據⑶3+/⑶4_ /⑶8_雙陰性T細胞的特性，體外分選出純化的CD3+/CD4- /CD8-雙陰性T細胞，利用多種細胞因子信號通路和TCR信號通路協同作用的原理，篩選出適合于雙陰性T細胞激活和病毒轉染的體外培養方案，能夠快速、可控的激活雙陰性T細胞，并將特定的嵌合抗原受體用慢病毒轉染技術高效率表達于雙陰性T細胞上，制備出CAR -DN-T細胞，使其能特異性的識別嵌合抗原受體對應的腫瘤細胞，促進CAR -DN-T細胞的進一步活化和增殖，并快速殺傷腫瘤細胞。
[0008]進一步的，所述體外分選方案為，利用CD4/CD8生物素標記抗體陰性分選和CD3/⑶28磁珠標記抗體陽性分選聯合使用，分選出高純度的⑶3+/⑶4_ /⑶8_雙陰性T細胞，然后對純化的雙陰性T細胞加入特定配比混合的細胞因子混合液刺激，培養72小時后進行嵌合抗原受體病毒轉染，得到高比例的CAR -DN T細胞。
[0009]優選的，所述細胞因子混合液包括:IL — 2、IL — 15、GMCSF、TNFa、IFNy。
[0010]本發明的有益效果是:
[0011]1、本發明首次將⑶3+/⑶4_/⑶8_雙陰性T(DN T)細胞作為母體細胞應用于CAR—T細胞的臨床應用上，利用DN — T細胞的MHC的非限制性，開發出新型的CAR — DN — T細胞應用于同源異體臨床治療。制備的CAR -DN-T細胞，可來源于同源異體的其他健康捐贈者(包括病人家屬等)，因此該細胞的制備擺脫了病人當下疾病狀況的限制，可提前大規模制備，并隨時根據臨床診斷結果對病人進行低劑量、多次回輸治療，可在滿足其療效的同時，有效控制CAR - T細胞可能誘發的多種毒副作用，降低CAR - T細胞的臨床使用風險。
[0012]2、本發明創建的新型DN — T細胞的激活方案，多種細胞因子和T細胞受體聯合刺激方案，能最大限度的提升嵌合抗原受體病毒的轉染效率，提高CAR -DN-T細胞的制備效率。
[0013]3、CAR -DN-T細胞可來源于健康人外周血的⑶3+/⑶4_ /⑶8_雙陰性T(DN T)細胞，由于健康捐贈者免疫系統健全，此種同源異體的CAR -DN-T細胞的活化、增殖和殺傷功能均強于患者自體來源的CAR - T細胞，腫瘤殺傷能力更強。
[0014]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。本發明的【具體實施方式】由以下實施例及其附圖詳細給出。
【附圖說明】
[0015]此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中:
[0016]圖1為CD3+/CD4_ /CD8_雙陰性T細胞示意圖；
[0017]圖2為⑶3+/⑶4_ /⑶8_雙陰性T細胞的分選、激活和嵌合抗原受體病毒轉染流程圖；
[0018]圖3為多種細胞因子和T細胞受體聯合刺激方案有效提升雙陰性T細胞病毒轉染效率對比；
[0019]圖4為自體CAR —⑶8 — T細胞和同源異體CAR -DN-T細胞體外殺傷試驗圖 ，
[0020]圖5為自體CAR —⑶8 — T細胞和同源異體CAR -DN-T細胞體外殺傷試驗圖-* *
[0021]圖6為CAR — T 一 19和CAR — DN — T細胞治療小鼠一人CD19+Raji B細胞淋巴瘤嵌合模型活體成像。
[0022]圖7為CAR — T 一 19和CAR — DN — T細胞治療小鼠一人CD19+RajiB細胞淋巴瘤嵌合模型生存曲線。
【具體實施方式】
[0023]下面將參考附圖并結合實施例，來詳細說明本發明。
[0024]鑒于當前CAR - T細胞治療的日趨成熟，其臨床的有效性也逐漸凸顯，因此，突破CAR — T細胞治療的個體限制，使其能規模化和產業化是當下急需解決的