抗美沙酮代謝物eddp雜交瘤細胞株及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細胞株及 其產生的單克隆抗體的應用。
【背景技術】
[0002] 美沙酮代謝物EDDP即為美沙酮在肝臟內經生物轉化，通過去甲基化形成無藥理 活性的吡咯烷（pyrrolidine)衍生物，其化學名為2-亞乙基-1，5-二甲基-3, 3-二苯基吡 咯烷（EDDP)。
[0003] 美沙酮是一種人工合成的麻醉藥品，屬于國家嚴格管制的麻醉藥品之一。美沙酮 可以用來治療海洛因及鴉片成癮。美沙酮是一種長效阿片類藥物，和海洛因等毒品不同，吸 毒人員服用美沙酮后，不會產生對毒品的依賴，也就是說不會產生毒品戒斷后的痛苦癥狀， 由于美沙酮是特殊藥品，所以對它的保管特別嚴格，一旦有人非法帶出醫院，將視為攜帶毒 品送交公安部門處理。通過檢測美沙酮代謝物EDDP來確定是否服用美沙酮。
[0004] 現有技術中，美沙酮可以采用儀器分析。儀器分析依賴技術要求高、檢測時間長、 成本高，檢測結果可靠性不高。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的是提供一種抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細胞株。
[0006] 本發明抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株9G2. 5,于2015年 1月15日保藏于中國典型培養物保藏中心（China Center for Type Culture Collection， 簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC N0:C201507;保藏地址是中國武漢武漢大學。該雜交瘤細胞 株能夠產生高特異性的抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體，生產效率高，成本低。
[0007] 本發明的另一個目的是提供雜交瘤細胞株9G2. 5分泌的抗美沙酮代謝物EDDP單 克隆抗體。該單克隆抗體具有較高的特異性、敏感性，交叉反應率低。
[0008] 本發明的第三個目的是提供抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體的制備方法，包括 步驟如下：
[0009] 步驟（1).小鼠免疫
[0010] 選擇8周齡的BALB/c雌鼠用美沙酮代謝物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉； 所述的后小腿肌肉部位為小鼠腿部暴露在外部有大塊肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被 腹部皮膚包裹，也可找到膝關節區分小腿大腿；
[0011] 取8周齡的BALB/c雌鼠，用美沙酮代謝物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每 隔1周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20 y g/只，第 一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫之前進行抗原乳化步驟，抗原乳化步驟是將美沙酮 代謝物EDDP人工抗原免疫量稀釋于20ulPBS緩沖液中，得到稀釋抗原，與等體積量的弗氏 完全佐劑乳化；后續二次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20ug/只，抗原乳化步驟與 第一次相同；最后1次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量改為5ug/只，抗原乳化步驟與第 一次相同。
[0012] 步驟（2).淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合
[0013] 2-1.飼養細胞制備：小鼠摘眼球處死，浸泡于75 %酒精中消毒，撕開小鼠腹外皮 膚，暴露其腹膜，注入37°C預熱的IMDM無血清培養基，輕揉小鼠腹腔，懸浮腹腔細胞，吸出 腹腔液；離心，沉淀物用1XHAT的IMDM培養液重懸，得到飼養細胞懸液。
[0014] 2-2.小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的培養：把小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用含體積分數為 10 % FBS的IMDM培養基進行傳代培養，細胞融合前一天進行傳代以保證小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0適合生長狀態良好用于細胞融合。
[0015] 2-3.淋巴細胞制備：取經步驟⑵處理的BALB/c雌鼠靠近淋巴結皮下部位的淋 巴結，研磨淋巴細胞至懸液；淋巴細胞懸液離心，取沉淀；在沉淀中加入MDM培養基，調整 淋巴細胞的濃度至1 X 107個/mL。
[0016] 2-4.淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合：采用聚乙二醇融合法。將調整濃度后的淋巴細 胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按細胞個數比為2 :1混合均勻，離心洗絳細胞，去除上清液，置 于37°C水浴，加入lmL 37°C預溫的PEG 1450,再加入25ml 37°C預溫的MDM無血清培養基 終止PEG作用；離心，取沉淀；然后在沉淀中加入步驟2-1的飼養細胞懸液，接種到96孔細 胞培養板中，置于37°C，5 % 0)2培養箱中培養。
[0017] 步驟（3).雜交瘤細胞的篩選
[0018] 3-1?初篩：
[0019] 融合細胞在5 % C02培養箱中培養3天后，換用1 X HT的IMDM培養液繼續培養4天 后，觀察96孔細胞培養板里的融合細胞生長情況，在細胞生長到細胞團簇（在16倍物鏡和 10倍目鏡下觀察，細胞大小占滿1/3視野）時，吸取融合細胞培養上清液，采用間接ELISA 方法篩選陽性克隆。
[0020] 所述的1 X HT的頂DM培養液含有體積分數為15 %的FBS。
[0021] 3-2?復篩：
[0022] 將篩選到的陽性克隆進一步用競爭抑制ELISA方法進行復篩，篩選出競爭抑制率 最高的9G2. 5雜交瘤細胞株做克隆培養。
[0023] 3-3.雜交瘤細胞株9G2. 5的克隆化：
[0024] 雜交瘤細胞株9G2. 5的克隆化培養按有限稀釋法進行，準確計數細胞，用含體積 分數為15 % FBS的頂DM培養基稀釋成4個/mL的細胞懸液，然后以每孔200ul稀釋后的 細胞懸液接種到96孔細胞培養板中，7天后觀察細胞生長情況，并檢測細胞培養板中細胞 培養上清液的抗體水平，選擇3個抗體效價最高的單克隆，做再次克隆化培養，直至單克隆 孔抗體檢測陽性率達到100 % ;然后挑取單克隆細胞，命名為9G2. 5,擴大培養后進行抗美 沙酮代謝物EDDP單克隆抗體純化。
[0025] 步驟（4).抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體純化
[0026] 將篩選到的單克隆細胞株9G2. 5用含體積分數為10 % FBS的MDM培養基接種到 24孔細胞培養板中，第二天接種到細胞培養瓶中，培養1天后，接種到細胞滾瓶中，滾瓶培 養4天后，收集培養上清液，將培養上清液濃縮后得到含有抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗 體的細胞培養濃縮液，然后用HiTrap PROTEIN G HP親和柱純化，得到純化后的抗美沙酮代 謝物EDDP單克隆抗體。
[0027] 所述的PBS緩沖液為含有0. 008M十二水磷酸氫二鈉、0. 15M氯化鈉、0. 002M二水 磷酸二氫鈉的水溶液，pH為7. 4 ;
[0028] 所述的1 X HAT的頂DM培養液含有體積分數為15 %的FBS。
[0029] 本發明最后一個目的是提供雜交瘤細胞株9G2. 5分泌的抗美沙酮代謝物EDDP單 克隆抗體在制備檢測美沙酮代謝物EDDP膠體金試紙條上的應用。美沙酮代謝物EDDP膠體 金試紙條產品具有快速，操作簡單等優點。為美沙酮代謝物的檢測提供了一種有效的現場 尿檢手段。本發明提供的EDDP雜交瘤細胞株所分泌的抗體用于膠體金試紙條上的標記原 料，尿檢的檢測閾值在l〇〇ng/ml。
[0030] 本發明所具有的有益效果：
[0031] 1.本發明在制備抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體過程中，采用小劑量肌肉注射 免疫方法，免疫效價高。
[0032] 2.雜交瘤細胞株9G2. 5能夠高效、穩定分泌抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體，并 且該單克隆抗體的效價高、特異性好、敏感性高，能夠大量生產，可用于制備檢測美沙酮代 謝物EDDP的酶聯免疫分析法試劑盒、膠體金試紙條等免疫學檢測試劑。
[0033] 3.采用本發明包含抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體的膠體金試紙條能快速且靈 敏地檢測尿液，具有高靈敏度特點，適用于l〇〇ng/ml閾值的檢測。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合實施例對本發明做進一步的分析（下面實施例中PBS緩沖液為含有 0. 008M十二水磷酸氫二鈉、0. 15M氯化鈉、0. 002M二水磷酸二氫鈉的水溶液，pH為7. 4 ;后 小腿肌肉部位為小鼠腿部暴露在外部有大塊肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮膚 包裹，也可找到膝關節區分小腿大腿；1XHAT的MDM培養液含有體積分數15 %的FBS ; 1 XHT的MDM培養液含有體積分數為15 %的FBS)。
[0035] 本發明抗美沙酮代謝物EDDP雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株9G2. 5,于2015年 1月15日保藏于中國典型培養物保藏中心（China Center for Type Culture Collection， 簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC N0:C201507 ;保藏地址是中國武漢武漢大學。
[0036] 本發明涉及的雜交瘤細胞株9G2. 5可分泌一種抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體。
[0037] 制備本發明涉及的雜交瘤細胞株9G2. 5并分泌抗美沙酮代謝物EDDP單克隆抗體 的方法，包括步驟如下：
[0038] 步驟（1).小鼠免疫：
[0039] 取8周齡的BALB/c雌鼠，用美沙酮代謝物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每 隔1周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20 y g/只，第 一次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量進行抗原乳化步驟，抗原乳化步驟是將美沙酮代 謝物EDDP人工抗原免疫量稀釋于20ulPBS緩沖液中，得到稀釋抗原，與等體積量的弗氏完 全佐劑乳化；后續二次美沙酮代謝物EDDP人工抗原免疫量為20ug/只，抗原乳化步驟與第 一次相同；最后1次美沙