一種自體自然殺傷細胞雞尾酒式培養的制備方法及其試劑盒產品的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種雞尾酒式制備自體自然殺傷細胞的方法，其中包括如下特征：其 中包括如下特征：來自于癌癥患者自身的外周血單個核細胞，在重組人白介素15、重組人 白介素18、重組人白介素21、重組人白介素12、重組人白介素7以及重組人MHC-I類鏈相關 分子A共同作用下激活自然殺傷細胞增殖，并增強自然殺傷細胞殺傷潛能；本發明還提供 了一種含通過上述方法而得到的自體自然殺傷細胞雞尾酒式培養的試劑盒，可在體外大量 增殖獲得自然殺傷細胞并具有殺傷活性，可用于各類癌癥包括實體瘤和血液腫瘤在內的多 個療程的免疫治療。
【背景技術】
[0002] 自然殺傷細胞（Natural Killer cells，NK)主要表達CD16+/CD56+表型，是先天 性免疫系統的重要組成部分，是機體抗感染免疫、抗腫瘤免疫及清除非己細胞的第一道防 線。與T淋巴細胞不同，NK細胞無需腫瘤特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細胞和病毒 感染的細胞。NK細胞功能的發揮由其細胞表面活化性受體和抑制性受體所傳遞的信號共同 決定，但在癌癥患者體內腫瘤細胞通過機體炎癥分子抑制NK細胞表面活化性受體表達，表 達抑制性受體從而逃避NK細胞殺傷。因而，激活NK細胞高表達活化性受體而活化其殺傷 活性就至關重要了，NK細胞對黑素瘤、肺癌、腎癌、結腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等 腫瘤治療有明顯療效。
[0003] NK細胞數量和殺傷功能與療效直接相關，治療中存在的問題在于獲得大量NK細 胞有限和培養時間過長。傳統使用的白介素2激活生長倍數有限，端粒長度縮短，培養時間 過長引起了 NK細胞殺傷功能低下。目前，臨床治療用的NK細胞培養技術也有采用基因工 程化和病毒轉染的滋養細胞與NK細胞共培養后，激活NK細胞增殖和活化其殺傷功能。
[0004] 本發明提供了 NK細胞雞尾酒式培養方法，即在含有重組人白介素15、重組人白介 素18、重組人白介素21、重組人白介素12、重組人白介素7以及重組人MHC-I類鏈相關分 子A共同作用下大量擴增NK細胞，30ml外周血來源單個核細胞培養至21天細胞增殖到 30 X 109以上，增殖倍數達到1000倍以上，NK細胞殺瘤活性在14-16天達到最佳，培養過程 中不需要基因工程化的滋養層細胞，簡單快速，為患者臨床治療大大節約了時間，并發揮出 最好的抗腫瘤作用，有助于提高臨床療效和延長患者生存期，而且可以大大降低細胞培養 成本。
【發明內容】
[0005] 本發明針對能更好地從癌癥患者自體的單個核細胞擴增獲得NK細胞，逆轉患者 體內NK細胞免疫抑制而增強其殺傷活性。本發明通過前期研宄實驗發現雞尾酒式培養方 法，即在含有重組人白介素15、重組人白介素18、重組人白介素21、重組人白介素12、重組 人白介素7以及重組人MHC-I類鏈相關分子A中三種以上細胞因子共同作用下誘導激活產 生NK細胞，培養至21天細胞增殖倍數達到1000倍以上，所述NK細胞經流式細胞儀檢測后 ⑶56+/⑶16+表型均大于80%，⑶3+細胞低于10%，并具有很強殺傷活性。
[0006] NK細胞發育依賴于白介素15(Interleukin-15, IL-15)，并促使組織中休眠的NK 細胞達到效應階段，具有促進淋巴細胞和NK細胞增殖和增強它們生物活性的功能；IL-18、 IL-21、IL-12、IL-7和MHC-I類鏈相關分子A是與其受體結合后可以顯著誘導了 NK細胞的 產生，調節NK細胞的增殖、分化并能提高NK細胞殺傷活性對腫瘤完全排斥，這些細胞因子 聯合作用對活化前的NK細胞功能是有效的誘導劑，并協同IL-15促進骨髓前體細胞增殖和 NK細胞增殖、分化和細胞毒活性，使其能殺死NK敏感的和NK抗性的腫瘤細胞。本發明通過 發揮這些細胞因子的協同作用機制，激活NK細胞增殖和增強其殺傷活性，抑制NK細胞中調 節性T淋巴細胞的增殖和產生，延長NK細胞端粒酶活性，可產生對腫瘤細胞最佳的殺傷活 性。
[0007] 本發明涉及體自然殺傷細胞雞尾酒式培養的制備方法，其中包括如下特征：來自 于癌癥患者30ml外周血的單個核細胞，在含有重組人白介素15、重組人白介素18、重組人 白介素21、重組人白介素12、重組人白介素7以及重組人MHC-I類鏈相關分子A中三種以 上細胞因子（優選同時含有上述細胞因子）共同作用下激活自然殺傷細胞大量增殖，培養 到21天細胞增殖倍數達到1000倍以上，并增強自然殺傷細胞的殺傷活性。
[0008] 本發明所述的雞尾酒式培養體系，為細胞培養基中含有lng-500ng/ml重組人白 介素15、lng_500ng/ml重組人白介素18、lng_500ng/ml重組人白介素21、lng_500ng/ml重 組人白介素12、lng-500ng/ml重組人白介素7以及lng-500ng/ml重組人MHC-I類鏈相關分 子A中三種以上細胞因子。雞尾酒式培養體系優選為細胞培養基中含有10ng-50ng/ml重組 人白介素15、10ng_50ng/ml重組人白介素18、10ng_50ng/ml重組人白介素21、10ng_50ng/ ml重組人白介素12、10ng-50ng/ml重組人白介素7以及10ng-50ng/ml重組人MHC-I類鏈 相關分子A中三種以上細胞因子。
[0009] 本發明所述制備自體殺傷細胞雞尾酒式培養方法為：采集癌癥患者30ml外周血， 經淋巴細胞分離液密度梯度離心獲得單個核細胞，將其在32ml的細胞培養基（含有5%自 體血衆、50ng/ml重組人白介素15、20ng/ml重組人白介素18、20ng/ml重組人白介素21、 20ng/ml重組人白介素12、20ng/ml重組人白介素7和50ng/ml重組人MHC-I類鏈相關分子 A中三種以上細胞因子）中，加入到細胞培養板中，在37°C、5% C02培養箱中繼續培養5天 以上。
[0010] 雞尾酒式激活培養5天后，將自然殺傷細胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的細胞 培養瓶中，并補充10_20mL新鮮細胞培養基（含50-500活性單位/mL重組人白介素2)，在 37°C、5% C02培養箱中繼續培養2-3天；將NK細胞轉移到細胞培養袋中，并繼續補充一倍 體積的新鮮細胞培養基（含50-500活性單位/mL重組人白介素2)，在37 °C、5 % C02培養箱 中繼續培養2-3天；然后自然殺傷細胞連續增殖培養到21天，使得細胞數達到30X 109以 上。
[0011] 所述雞尾酒式培養試劑，優選地，外周血單個核細胞在24孔細胞培養板、12孔細 胞培養板或6孔細胞培養板中連續培養5天以上，誘導激活NK細胞。
[0012]自然殺傷細胞優選地，來源于癌癥患者手術一個月后、放化療一個月后采集的新 鮮外周血。NK細胞臨床治療中采取1個療程4-8次的回輸治療，即每周采集外周血1次，應 用于1次NK細胞的回輸，共完成1個療程的4-8次的治療。
[0013] 本發明使用的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基或RPMI 1640培養基加入 50-500活性單位/mL重組人白介素2和10% (體積比）自體血清或胎牛血清，優選地，細胞 培養基為淋巴細胞無血清培養基，如 RPMI1640、CellGro@SCGM、Tex?MACS、K0HJIN@GT-T502、 X-VIVO和GT-H551等，含有500活性單位/mL重組人白介素2，該低濃度白介素2可促進NK 細胞的增殖，維持NK細胞長期生長。
[0014] 本發明還提供了雞尾酒式制備自體自然殺傷細胞的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒包括：
[0015] (1) 200ml淋巴細胞分離液；
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