使用CYP153烷烴羥化酶由烷烴或1-烷醇生產α,ω-二醇的方法
【專利說明】使用CYP153烷烴羥化酶由烷烴或1 -烷醇生產α , ω - 二醇的方法
[0001]本發明涉及包括如下步驟的方法
a)提供燒徑或1-燒醇，
b)使所述烷烴或1-烷醇在水溶液中與來自CYP153家族的細胞色素P450烷烴羥化酶和氧氣接觸至少3小時。
[0002]取代的烷烴，例如醇、醛、酮、羧酸和胺，代表了一類在工業上受歡迎的化合物，這些化合物傳統是通過對由化石碳源制得的化合物進行轉化來制備。在不可再生的礦物燃料的供應日益受限的時代，從可再生資源(即可以容易地和(從地質年代表的角度來看)快速地補充的材料)開始生產烷烴及其衍生物的生物技術工藝受到廣泛關注。
[0003]現有技術中已報道了多種將烷烴轉化為取代的烷烴，特別是氧化烷烴的方法。甲烷單加氧酶催化一個氧原子NADH-依賴性地插入甲烷的特別穩定的C-H鍵，形成甲醇，這是通過甲燒氧化菌如發孢甲基彎菌{Methylosinus trichosporium)和莢膜甲基球菌{Methylococcus capsulatus)降解甲燒的第一步。可溶性甲燒單加氧酶典型地具有寬的底物范圍，包括至多達大約C8的飽和的和不飽和的、線性的、分枝的和環狀的烴，以及芳香的、雜環的、和含氯的化合物(Merkx M, Kopp DA, Sazinsky MH, Blazyk JL, MilllerJ, Lippard SJ (2001), Angew Chem Int Ed Engl 40:2782-2807; Higgins IJ, BestDJ, Hammond RC.1980)。在甲烷利用細菌中的新發現突出了它們在生物圈的重要性和它們的商業潛力。依賴于紅素氧還蛋白的燒徑單加氧酶如來自惡臭假單胞菌iPseudomoimsput I da) GPol的烷烴單加氧酶催化中等鏈長度的烷烴的氧化，產生醇和羧酸的混合物
(Grant C., Woodley, J.M, and Baganz, F (2011) Enzyme and Microbial Technology48, 480-486)。
[0004]但是，具有兩個或更多個取代的烷基對于許多應用來說是必不可少的，例如在工業聚合物的生產中作為交聯劑，在這種情況下，通過這種生物技術方法可以獲得的取代度受到限制。已報道有許多系統將烷烴轉化為相應的1-烷醇，但是存在很少的可以用于生產相應的α，ω-二醇的生物技術方法，α，ω - 二醇即其中兩個末端碳原子的每一個都攜帶一個羥基的烷基鏈。而且，許多氧化酶易于過度氧化烷烴底物，導致不希望的醛和羧酸污染所需的醇產物的效果。最后，氧化需要是有選擇性的，這意味著優選除了末端碳原子之外的烷烴碳原子不應被氧化。
[0005]因此，本發明的根本問題提供了將烷烴或1-烷醇轉化為相應的α，ω- 二醇的生物技術路線，其中過度氧化的程度受到限制，和/或反應是足夠特異性的，優選除末端碳原子之外的碳原子不被取代或者被取代的程度較低。
[0006]在第一方面，本發明的根本問題通過包括下述步驟的方法來解決
a)提供燒徑或1-燒醇，
b)使所述烷烴或1-烷醇在水溶液中與來自CYP153家族的細胞色素P450烷烴羥化酶和氧氣接觸至少3小時。
[0007]在第二方面，本發明的根本問題通過使用來自CYP153家族的細胞色素P450烷烴羥化酶使烷烴或1-烷醇轉化為相應的α，ω - 二醇來解決。
[0008]在第一或第二方面的第一實施方案中，通過方法或用途解決問題，其中在存在來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶的條件下溫育烷烴或1_烷醇至少3、優選16、最優選24小時。
[0009]在第一或第二方面的第二實施方案中，其也是第一或第二方面的第一實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中，除了來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶之外，還存在鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶，其中鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶兩者均能夠在功能上與所述來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶相互作用。
[0010]在第一或第二方面的第三實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第二實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶是來自泊庫島食燒菌iAlcrniivorax borkumensis)的CYP153家族的細胞色素P450燒烴羥化酶(登錄編碼YP_691921)或其變體，鐵氧還蛋白是來自泊庫島食烷菌的鐵氧還蛋白(登錄編碼ΥΡ_691921)或其變體，并且鐵氧還蛋白還原酶是來自泊庫島食烷菌的鐵氧還蛋白還原酶(登錄編碼ΥΡ_691923)或其變體。
[0011]在第一或第二方面的第四實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第三實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中烷烴或1-烷醇是具有1-7個，優選1-4個碳原子的烷烴。
[0012]在第一或第二方面的第五實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第四實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中烷烴是丁烷或異丁烷。
[0013]在第一或第二方面的第六實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第五實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中烷烴或1-烷醇是具有1-7個碳原子的1-烷醇，優選丁醇或異丁醇。
[0014]在第一或第二方面的第七實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第六實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中烷烴是以分壓1-50，優選1-20，最優選1-10 bar提供的氣態烷烴。
[0015]在第一或第二方面的第八實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第七實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中至少一種選自包含來自CYP153家族的細胞色素P450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶的組的酶以表達所述一種酶(enzyme)或多種酶(enzymes)的全細胞催化劑的形式提供。
[0016]在第一或第二方面的第九實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第八實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中所有選自包含來自CYP153家族的細胞色素P450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶的組的酶以表達所述酶的全細胞生物催化劑的形式提供。
[0017]在第一或第二方面的第十實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第九實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中至少一種，優選所有選自包含來自CYP153家族的細胞色素P450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶的組的酶是重組的和/或過表達的，優選是過表達的。
[0018]在第一或第二方面的第十一實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第十實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中全細胞生物催化劑表達來自AlkL家族的多肽，優選來自惡臭假單胞菌的AlkL (登錄編碼CAB69081)或其變體。
[0019]在一個或第二個方面的第十二實施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第十一實施方案的實施方案，通過方法或用途解決問題，其中全細胞生物催化劑是原核細胞，優選大腸桿菌{E.coli)。
[0020]在第三方面，本發明的根本問題通過使用根據第一或第二方面的方法或者第一或第二方面的任一實施方案使烷烴轉化為相應的α，ω-二醇來解決。
[0021]本發明基于令人驚訝的發現，即來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶可用于將烷烴不僅轉化為相應的1-烷醇，而且還轉化為相應的α，ω-二醇。
[0022]本發明集中于方法或用途，其包括使烷烴或1-烷醇與來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶接觸的步驟。在優選的實施方案中，本文使用的術語“來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶”指胞質細胞色素氧化酶，其是3組分系統的天然部分，所述3組分系統不僅包括氧化酶，還包括鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶，其中氧化酶具有烷烴結合位點并能使烷烴羥基化。在更優選的實施方案中，來自CYP153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶與來自泊庫島食烷菌SK2的細胞色素Ρ450氧化酶(登錄編碼ΥΡ_691921)具有至少80%，優選90%，更優選95%以及最優選99%的氨基酸序列同一性，此外還具有烷烴羥化酶活性。在另一個優選的實施方案中，細胞色素Ρ450烷烴羥化酶除了具有所述氨基酸序列同一性程度、所述結合位點和所述烷烴羥化酶活性之外，還具有氨基酸序列基序LL(I/L) (V/I)GGNDTTRN。本申請通篇引用的數據庫編碼指NCBI數據庫2012年10月12日在線版本的編碼。
[0023]為了盡可能有效地從還原劑提供電子供應，以維持細胞色素P450烷烴羥化酶的羥化酶活性，優選烷烴羥化酶與功能上與所述烷烴羥化酶相互作用的鐵氧還蛋白還原酶以及鐵氧還蛋白組合使用。在使用全細胞生物催化劑提供細胞色素P450烷烴羥化酶的情況下，鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶可以是分離的多肽，或者可以是共表達的。本領域技術人員可以容易地通過在存在烷烴底物和三種多肽的條件下，監測還原劑的氧化是否超出背景水平，來確定鐵氧還蛋白還原酶和/或鐵氧還蛋白是否與目標細胞色素P450烷烴羥化酶在功能上相互作用，所述三種多肽優選是分離的多肽。或者，在使用在功能上相互作用的多肽的情況下，可以使用 Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B.M, undHauer, B.(2011) Org.B1mo1.Chem., 9, 6727所述的酶測定來指示升高的反應速率。在優選的實施方案中，來自CYP 153家族的細胞色素Ρ450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶來自相同生物體，優選來自泊庫島食烷菌SK2，在這種情況下，登錄編碼分別是 ΥΡ_691921、ΥΡ_691923 和 ΥΡ_691920。
[0024]在優選實施方案中，本文使用的術語“接觸”是使烷烴或1-烷醇與氧化還原酶之間發生直接接觸，以使得后者能夠氧化前者。例如，細胞和烷烴或1-烷醇可能不處于由膜(例如對于目標細胞和烷烴或1-烷醇來說是不能滲透的無機膜)分隔開的不同的空間中。如果烷烴或1-烷醇是固體的或是可溶的，可以簡單地將其加入到水溶液中的氧化還原酶中。如果烷烴或1-烷醇是氣態的，包含細胞的水溶液可以與包含所述氣態烷烴或1-烷醇的