與紅麻細胞質不育相關的snp分子標記及其擴增引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物檢測領域，具體地說，設及與紅麻細胞質不育相關的SNP分子標 記及其擴增引物。
【背景技術】
[0002]紅麻化ibiscyScann油inySL.)是錦葵科（Malvaceae)木穫屬化ibiscyS) 一年生草本初皮纖維作物，W收獲莖桿或初皮纖維為栽培目的。而雜種優勢的利用極大 的提高了紅麻的莖桿和初皮纖維產量，紅麻表現出強大的雜種優勢，其優勢率高達35%~ 40%。長期W來，紅麻雜種優勢利用是國內外紅麻育種的主攻目標，而雜種優勢的利用有賴 于紅麻不育細胞質的發掘，因此，發掘新的、不同類型的不育細胞質成為紅麻雜交育種迫切 要求。周瑞陽（2008)報道的紅麻CMS系均為野敗型UG93細胞質，在生產上大面積推廣來 源于單一細胞質的雜交種存在較大的風險，極可能成為某一病害生理小種的哺育品種，弓I 起該一病害大流行。因此，開發出能準確區別現有的不育細胞質的方法具有重要的意義。
[0003] 為了選育新的雄性不育細胞質，一般利用現有雄性不育保持系與現有種質資源測 交的方法篩選，不但工作量很大，而且帶有很大的盲目性。若能找到一種快速準確鑒別紅麻 雄性不育細胞質的方法，則可利用該種方法對現有種質資源進行鑒定，W發掘出新的雄性 不育細胞質資源，繼而選育出新的雄性不育系。由此將極大地提高工作效率，并有利于現有 雄性不育系及其雜交種的知識產權保護。
[0004]SNP(SingleNucleotidePolymo;rphism,單核巧酸多態性）技術，指由于單個核巧 酸堿基的改變而導致的核酸序列的多態性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核巧 酸序列中，絕大多數核巧酸序列一致而只有一個堿基不同的現象，即SNP，而將分布在基因 編碼區的SNP稱為cSNP，屬功能性突變。
[0005] 關于利用線粒體基因atp9的編碼區的cSNP位點鑒定紅麻不育細胞質的方法，目 前未見相關報道，該鑒定方法能有效的鑒定出來源UG93野敗型突變體的不育細胞質，保護 現有雄性不育系及其雜交種的知識產權保護。
【發明內容】
[0006] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種與紅麻細胞質不育相 關的SNP分子標記及其擴增引物。
[0007] 為了實現本發明的目的，本發明首先提供一種與紅麻細胞質不育相關的SNP分子 標記，所述分子標記來自atp9基因，其核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示，第290bp處為突變 位點，堿基為A或T。
[000引進一步地，所述突變位點的堿基為T時，紅麻細胞質不育；所述突變位點的堿基為A時，紅麻細胞質可育。
[0009] 本發明還提供了用于擴增所述SNP分子標記的引物對，所述引物對中，正向引物 atp9QF如SEQIDNo. 2 所示、反向引物atp9QR如SEQIDNo. 3 所示。
[0010] 本發明還提供了用于檢測所述SNP分子標記的試劑盒，所述試劑盒含有正向引物 atp9QF如SEQIDNo. 2 所示、反向引物atp9QR如SEQIDNo. 3 所示。
[0011] 本發明還提供了一種檢測紅麻細胞質不育的方法，所述方法為；W待測紅麻樣品 的基因組DNA為模板，利用前述引物對，通過PCR反應進行擴增，并對擴增產物進行測序，根 據測序結果第290位點處的堿基判斷樣品細胞質是否不育。
[0012] 進一步地，所述堿基為T時，紅麻細胞質不育；所述堿基為A時，紅麻細胞質可育。
[0013] 本發明還提供了一種檢測紅麻細胞質不育的試劑盒，所述試劑盒含有前述引物 對。
[0014] 本發明還提供了所述SNP分子標記在檢測紅麻細胞質不育中的應用。
[0015] 本發明的有益效果在于：
[0016] 本發明基于線粒體基因atp9全長測序的基礎上，通過比對紅麻不育系、保持系W 及Fi代材料間的序列，發掘不育細胞質與可育細胞質材料間同一位點的堿基差異即cSNP， 從而提供了一種與紅麻細胞質不育相關的SNP分子標記及其擴增引物。
[0017] 利用本發明所提供的SNP分子標記能將具有紅麻不育細胞質的材料區別開來，非 常適用于鑒別材料間不育細胞質的真實性，對保護紅麻細胞質雄性不育系的知識產權起到 重要作用。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明實施例1中紅麻線粒體基因atp9擴增圖譜；
[0019] 其中，M ;marker，泳道1 ;不育系P3A ;泳道2 ;保持系P3B ;泳道3 ;Fi。
[0020] 圖2為本發明實施例1中具有不育細胞質和可育細胞質材料的atp9序列比對部 分截圖。
[0021] 圖3為本發明實施例2中已知不育細胞質和可育細胞質材料的atp9序列比對部 分截圖。
[0022] 圖4為本發明實施例2中未知不育細胞質和可育細胞質材料的atp9序列比對部 分截圖。
【具體實施方式】
[0023]W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0024] 下列實施例中所用方法如無特殊說明均為常規方法。所用原料都可從商業途徑獲 得。引物合成及測序工作均由華大基因完成。
[0025] 實施例1與紅麻細胞質不育相關的SNP分子標記的發掘
[0026] 本實施例的試驗材料為紅麻細胞質雄性不育系P3A、保持系P3B及Fi代，其中P3A、 P3B均為公知公用品種，具體信息如下：
[0027]P3A;又名粵豐1號A，見發明專利化200510019454. 4 (公開號CN100415083C)。
[0028]P3B;又名粵豐1號B，廣西大學周瑞陽老師選育的細胞質雄性不育系P3A的雄性 不育保持系，見發明專利化200510019454. 4 (公開號CN100415083C)。
[0029] Fi代；W紅麻細胞質雄性不育系P3A為母本，恢復系福紅992為父本組配的雜交F1 代，Fi代的細胞質在理論上與親本不育系具有相同的雄性不育細胞質。
[0030] 1.基于測序發掘線粒體atp9基因的特異cSNP位點
[0031] (1)線粒體atp9基因編碼區引物設計
[0032] 基于紅麻細胞質雄性不育系P3A線粒體基因atp9全長的序列
[0033] SEQ ID No. 1，設計了atp9基因編碼區特異引物；
[0034] atp9QF ；ATGAATGATAAAGCGCGTGACGAGA；
[00巧]atp9QR ;TCAGCACGGTGCAGTCTCCACTTTA。
[0036] (2) atp9基因編碼區擴增
[0037] 分別W紅麻不育系P3A、保持系P3B和Fi代的曲NA為模板進行PCR擴增，擴增 的20yL反應體系包括20-50ng/yL的曲NA模板，2uL的10XByffer，0. 6uM的上下 游引物，用水補足20yL。該反應混合物首先95°C預變性3min，然后94°C40s，63°C20s， 72°C20s，擴增35個循環，最后72°C終延伸3min，PCR反應產物用1%的瓊脂糖檢測。紅麻 線粒體基因atp9的擴增結果顯示，該=個材料均獲得了大小約為3(K)bp的電泳條帶，經測 序得知此該S條帶大小均為339bp(見圖1)。
[003引 （3)已知不育細胞質和可育細胞質材料間特異cSNP位點發掘
[0039] 分別選取上述材料3個曲NA克隆子進行測序，采用DN