一種基于高分辨率熔解曲線判定大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥水平的分子檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種基于高分辨率烙解曲線判定大腸桿菌對嗟諾酬類藥物耐藥水平 的分子檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 嗟諾酬類藥物自首次投入使用后，因廣譜高效、抗菌機制獨特而被廣泛應用于醫 學領域。不合理的使用及復雜的耐藥機制，導致細菌對該類藥物的耐藥性問題日益嚴重，嚴 重制約其使用效果。因此對該類藥物耐藥問題的研究顯得刻不容緩。然而目前判斷細菌對 嗟諾酬類藥物耐藥水平的方法仍W傳統的藥敏實驗為主，從樣本采集到報告結果常需數天 時間，阻礙了人們及時合理地選擇敏感藥物。
[0003] 目前研究發現細菌對嗟諾酬類藥物耐藥的機制主要有S類；DNA拓撲異構酶II (回旋酶）與拓撲異構酶IV基因突變導致藥物失去作用位點、質粒介導的細菌對嗟諾酬類藥 物的抗性、細菌的主動外排機制。后兩種機制主要與細菌的低濃度耐藥有關，基因的突變和 高濃度耐藥有關。DNA拓撲異構酶II和拓撲異構酶IV，在核酸合成中起調控DNA拓撲學狀態 的作用。DNA拓撲異構酶II為Gyrase A和Gyrase B兩個亞單位構成的異四聚體，可共同作 用將DNA正超螺旋的一條單鏈切開、移位、封閉，引入負超螺旋，在DNA復制中起重要作用。 拓撲異構酶IV主要功能是通過松弛DNA超螺旋、解除DNA結節和解環連體而發揮去除DNA 纏繞的作用，并對子代染色體的分離具有重要作用。嗟諾酬類藥物通過結合旋轉酶或拓撲 異構酶IV，影響酶的功能、阻斷細菌DNA的復制而引起菌體死亡。拓撲異構酶II編碼基因或 拓撲異構酶IV編碼基因的點突變可能會影響藥物和酶的結合而降低細菌對其敏感性。應用 常規PCR對細菌耐藥機制進行研究，需要在擴增結束后對產物進行測序分析，費時較長。因 此亟需一種快速準確的方法鑒別大腸桿菌，且能快速判斷其對嗟諾酬類藥物的耐藥水平。
【發明內容】
[0004] 嗟諾酬類藥物被廣泛應用于人類及動物疾病的治療，但是細菌對該類藥物耐藥性 與日俱增，極大制約了此類藥物的使用效果及應用范圍。拓撲異構酶II編碼基因或拓撲異 構酶IV編碼基因的點突變可能會影響藥物和酶的結合而降低細菌對其敏感性。研究發現大 腸桿菌臨床分離株的6了356 ^基因突變居多且與細菌的高濃度耐藥性有關。然而目前判 斷該些突變位點的最主要方式仍是通過PCR擴增后進行核酸測序的手段。
[0005] 本發明提供了一種快速鑒定大腸桿菌及其耐藥性水平的檢測手段，可快速判斷某 些對大腸桿菌耐嗟諾酬類藥物影響顯著的突變點。鑒于嗟諾酬類藥物在醫學領域的廣泛應 用，本發明專利將會帶來可觀的經濟效益，使用本發明的手段可快速、方便、有效地為合理 用藥提供重要參考，并為耐藥性研究提供技術支持。
[0006] 本發明提供了一種可快速、敏感、準確判斷大腸桿菌對嗟諾酬類藥物耐藥水平的 檢測試劑盒，本發明的試劑盒可特異性擴增大腸桿菌的核酸，而不擴增其它細菌、病毒、寄 生蟲、植物、動物等的核酸，并且可應用于多種組織器官與物種來源的臨床樣本，無需細菌 分離純化。
[0007] 本發明選擇場rase遍j因作為目標基因，場rase遍j因的突變在大腸桿菌臨床 分離株中居多，并與細菌的高濃度耐藥性有關，其N端的高頻突變區被認為是嗟諾酬類藥 物耐藥決定區（Q畑R，quinolone resistance-determining region)。本發明通過設ir|對 引物和探針，特異擴增所有大腸桿菌的核酸，PCR擴增產物包含QRDR區，探針結合區即在該 區高頻突變點所在區域。探針結合區內堿基的錯配會導致解鏈溫度（rj變化，每種突變對 應特定的r。。因此，通過r。，即可區分不同的點突變類型，快速確定大腸桿菌對嗟諾酬類藥 物的耐藥水平。
[0008]本發明從GenBanKWWW.ncbi.nlm.nih.gov)獲取場rase基因（NCBIReference Sequence:NZ_ASHD01000043. 1)的序列。
[0009] 本發明的技術方案是； 一種用于判定大腸桿菌對嗟諾酬類藥物耐藥水平的引物，包括上游引物和下游引物， 其核巧酸序列為： 上游引物；5，-ctttacgccatgaacgtactaggc-3， 下游引物；5, -tttccgtaccgtcatagttatcaac-3，。
[0010] 一種用于判定大腸桿菌對嗟諾酬類藥物耐藥水平的探針，包括探針-1和探針-2， 其核巧酸序列為： 探針-1:5'-ggggatggtatttaccgattacgtcaccaacgaca-6-FAM-3' 探針-2:5，-LCRED64〇-acgatcgtgtcataaaccgccgagtcacca-磯酸-3。
[0011] 一種判定大腸桿菌對嗟諾酬類藥物耐藥水平的分子檢測試劑盒，包括上述的引 物，還包括上述的探針。
[0012] 所述的試劑盒還包括用上述引物進行PCR擴增的步驟。
[001引 PCR用的標準定量試劑；由IDT合成場rase^基因的核酸序列，此序列涵蓋PCR的 擴增區域。依據合成物的分子量和絕對重量化及PicoGreen的DNA定量技術，計算合成物 所含的6了ase^基因的拷貝數。隨后，對合成物進行稀釋，制備每lOyl合成物的稀釋試 劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝目的基因，作為PCR的標準定量試劑； 待檢樣品的DNA模板；本發明所用的檢測模板包括大腸桿菌的核酸、沙口菌核酸、寄生 蟲核酸(球蟲和弓形蟲的核酸)、病毒核酸(禽流感病毒全核酸)、動物的核酸(犬全血核酸)。 PCR擴增體系為；20y1的擴增體系，包10y1的樣品DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩沖液、1uM上游引物-1、1uM下游引物、0. 2yM的6-FAM探針、0. 2yM的LCRed640 探針、2個單位的商業化Taq酶、200yMdNTP。 PCR擴增條件為；共 40 個循環，95°C10s，56°C15s, 72°C15So[0014] PCR擴增結束后進行高分辨率烙解曲線分析；將溫度從45DC逐漸上升到 85°C，W每秒0. 11。C遞增，持續監測巧光強度的變化，分析F4/F1，即640皿:530皿的 巧光強度的比值，F4/F1的第一衍生值-d(F4/F1)/化被讀為該DNA的烙解溫度。
[00巧]根據巧盧度判斷點突變類型原理圖解如圖1所示；圖1的上圖中（A圖），橫坐標 表示溫度，縱坐標表示巧光強度，曲線表示巧光強度同溫度變化的關系；圖1的下圖（B圖） 中，橫坐標表示溫度，縱坐標表示單位時間內巧光強度的變化同時間的比值，曲線表示該比 值同溫度間的關系。PCR擴增結束后，對產物進行高分辨率的烙解曲線分析，溫度從40°C逐 漸升高至85°C。探針逐漸同PCR產物分離，巧光強度下降。當巧光強度下降速度最快時，該 點的溫度即為巧盧度。模板存在點突變時會導致探針與模板的堿基無法完全匹配，而使相 互結合的能力下降，rji之發生變化。
[0016] 本發明從五個方面保證6了ase^FRET-qPCR的特異性； 1) 本發明設計的引物和探針經過GenBank的BLAST捜索，確認本發明設計的引物能 特異地擴增大腸桿菌6了356如勺基因，而不擴增其它細菌、病毒、寄生蟲、植物、動物的核酸 (在臨床樣本中，細菌的核酸常同該些核酸混合在一起)。同時，通過BLAST確認，一對上下 游引物和二個探針能特異地擴增和檢測所有大腸桿菌6了ase^基因的核酸； 2) 本發明檢測了來自不同物種(雞、鴨、豬、牛)、不同組織及器官(肝、肺、腸、奶、精液） 臨床樣本的核酸； 3) 觀察W上擴增對象在PCR過程中巧光強度（640nm)的變化，W及PCR擴增產物在瓊 脂糖凝膠電泳的條帶的大小。巧光在640nm波長出現或增強，顯示陽性；PCR擴增產物在 瓊脂糖凝膠電泳顯示預期的316bp大小的條帶； 4) 對擴增的PCR產物進行測序，測序的結果和GenBank的標準序列進行比對。
[0017] PCR靈敏度的確定； 由IDT合成6了^基因的代表序列。依據合成物的分子量和絕對重量W及PicoGreen的DNA定量技術，計算合成物所含基因拷貝的絕對數目。隨后對合成物進行稀 釋，制備每10y1合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的基因。用 本發明系統擴增含不同基因濃度的DNA模板，確定本發明檢測此基因的靈敏度。結果顯示， 本發明的反應系統可擴增10拷貝/體系濃度的模板，如圖2所示。
[001引本發明建立了一套基于大腸桿菌拓撲異構酶II編碼基因（(水rase^基因）的FRET-qPCR檢測試劑盒，可直接應用于臨床樣本，無需細菌分離、純化。該系統可高度敏感、 特異地擴增不同物種(雞、鴨、牛、豬、）、組織器官(肝、肺、腸、奶、精液）來源大腸桿菌的核 酸，而不擴增其他細菌、病毒、寄生蟲、植物、動物的核酸。本發明設計的擴增片段包含一段 嗟諾酬類藥物耐藥決定區（QRDR)。拓撲異構酶編碼基因上的點突變可能會改變酶的性狀而 影響藥物和酶的結合，從