一種檢測Leber病線粒體T14502C試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物技術領域，設及用于檢測與Leber病相關的線粒體DNAT14502C突 變的試劑盒，還設及一種與Leber病相關的線粒體基因突變的檢測方法，特別設及檢測線 粒體M?W14502C突變的方法，W及上述方法或上述的試劑盒在檢測與Leber病相關的線粒 體DNAT14502C突變中的應用。
【背景技術】
[0002] Leber遺傳性視神經病變化eber'SHereditaryOpticNeuropathy,LH0N，簡稱 Leber氏病）是一種母系遺傳性視神經病變，主要累及視網膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束 纖維，導致視神經退行性變的母系遺傳病，嚴重的影響著人們正常的生產、生活。根據國家 衛生部（http://www.moh.gov.cn/)最新數據統計我國現有的低視力人口約有710萬，盲人 約有500萬，占總人數的0. 4%，成為世界上視力損傷最嚴重的國家之一。其中，由視神經病 變引起的約為55萬。1871年德國眼科醫生化eodorLeber首次報道該病的臨床癥狀、體征 和遺傳特性。1972年化ickson等發現LH0N的遺傳方式呈典型的母系遺傳特征。1988年 WallaceDC等發現了第一個與LH0N相關的線粒體基因組DNA(mitochon化iaDNA,mtDNA) 突變位點MWG11778A。目前已報道50多種線粒體DNA突變位點與LHON致病相關化ttp:// WWW.mitomap.org/)，其中90%W上的LH0N的家系是由氧化磯酸化復合物I亞基上的AZW G11778A、您2G3460A和瓜WT14484C該3個原發突變位點所致。為了進一步探究LH0N的 發病機制，在全國范圍內收集了大量的L冊N家系，除上述3個原發性突變位點外，相繼發現 了tRNAMetA4435G、瓜WG11696A、tRNAT虹A15951G、#WT3866C、#WTSSgAC.yWfTlSSSSC和 MWT14502C突變與LHON相關，與線粒體相關的Leber氏病在早期臨床癥狀不明顯，早期的 檢查常常會因此被耽誤，尤其在我國偏遠農村地區，該種情況普遍存在。因此，在高危人群 和易感人群中開展mtDNA突變篩查，對于預防和控制與線粒體相關的原發性Leber氏病的 發生有著極其重要的作用。
[0003] 自發現與mtDNA突變相關的疾病W來，檢測線粒體突變位點的檢測方法主要還是 序列測定。直接測序法是鑒定突變的黃金標準，但該操作繁瑣，費用昂貴限制了它的廣泛應 用。
[0004] 近年來，國內相繼報道了Leber遺傳性視神經病變的基因診斷試劑盒及其檢測 方法，W滿足對線粒體突變突變進行廣泛篩查的需要，如福建醫科大學于2005年申請了 的基因診斷試劑盒及其檢測方法專利(專利號；200510006097.8)，該發明是根據90%W 上的Leber氏遺傳性視神經病變患者的線粒體DM突變屬于3個原發性致病位點突變 (G11778A、G3460A和T14484C)，設計和合成位點特異性PCR引物，直接W全血樣作PCR的 DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術，單管一次性PCR反應，同時檢測LH0N患者的 線粒體DNA的3個原發性致病突變位點，具有簡便快速、高效、費用低、特異性好、只需微量 血液樣本等優點，為LH0N患者的快速臨床基因診斷提供一種簡易、可靠的方法和試劑盒， 具有巨大的普及推廣應用價值。但是該方法存在血液中直接PCR擴增的難度加大，實驗中 采取的多重PCR的條件要求將會增加，檢測方法跟普通的方法沒有本質的區別。2006年 杭州優思達生物科技有限公司建立一種W單核巧酸多態性核酸試紙快速檢測LHON線粒體 DNA中G11778A位點突變的新方法(專利號；200610003429. 1)。在應用單核巧酸多態性核 酸檢測試紙條進行多態位點或突變位點的檢測時，需要設計一條特異性延伸引物，該條引 物的3'端堿基緊臨多態性堿基或突變堿基，其在DNA聚合酶的作用下開始延伸，帶有抗 原標記與模板對應的雙脫氧單核巧酸（ddNT巧被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠實現 短時間內的檢測陽性位點，但PCR擴增條件嚴格，存在假陰性的幾率大大增加。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對目前檢測T14502C突變的方法所存在的缺點，提供一種 快速、簡便、準確、經濟的檢測Leber病相關的線粒體DNAT14502C突變的試劑盒。
[0006] 本發明提供的試劑盒，由DNA提取混合液、擴增T14502C片段的PCR混合液、針對 T14502C設計的一對外引物、針對T14502C設計的一對內引物、限制性內切酶、陽性對照、 陰性對照組成。其中，提取DNA提取混合液主要由細胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酪、無水 酒精組成；擴增T14502C片段的PCR混合液試劑包括dNTP(脫氧單核巧酸）、10XPCR緩 沖液、1肖(：12、；蒸水和賠g酶值NA聚合酶），針對T14502C設計的外引物包括外前向引物 F:GCATAATTAAACTTTACTTC(SEQIDN0:1)，外反向引物R:AGAATATTGAGGCGC CATTG(SEQIDN0:2);針對T14502C設計的內引物包括內前向引物F:TACTCCTCAATA GCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTAAATTAA(SEQID側:3)，內反向引物尺： TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA(SEQIDN0:4);限制性內切酶包括限制性內切酶化cl;陽 性標本對照是含有線粒體序列第14502位點發生酶切樣本；陰性標本對照是線粒體序列第 14502位點不能夠發生酶切樣本。
[0007] 在上述試劑盒中，在擴增T14502C的PCR混合液中添加用于提高延伸反應特異性 的少許二甲基亞諷（0.1-0.2y1為宜） 本發明的另一個目的是提供所述試劑盒在檢測與Leber病相關的線粒體基因MVT14502C突變中的應用。通過W下步驟實現： (1) 基因組DNA的提取：運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛發、 口腔粘膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA; (2) 特異性PCR擴增；使用Primer5. 0軟件和01igo7. 0軟件根據SEQIDNO: 5所示 的人類線粒體基因序列所設計的引物F% /R%、Fh/Rh是能擴增出包含上述Leber病的線粒 體突變位點的片段，F外/R外擴增出為線粒體DNA的核巧酸14081-15017,其序列為序列表 中的SEQIDNO: 1、2 ;F內/R內擴增出為線粒體DNA的核巧酸14441-14656,其序列為序列 表中的SEQIDN0:3、4 (3) 酶切鑒定；將上述PCR產物用限制性內切酶化cl對T14502C突變位點處進行酶 切； (4) 突變檢測；聚丙締酷胺凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量 及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生T14502C突變。
[0008] 在上述檢測mtDNAT14502C突變的方法中，可從血標本巧日一滴血)、帶毛囊的毛 發、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，根據取樣方式或被測樣本形式不 同，對不同樣本進行相應的預處理，處理方法如下： (1) 血標本巧日一滴血）；取20~200y1少量血標本巧日一滴血）或1cm2的血濾紙片放 入1.5mlEP管(離屯、管)，加入900yl紅細胞裂解緩沖液（20mmol/LTris-HCl，抑7.6)(S 哲甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液）室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000巧m離屯、Imin，收 集白細胞沉淀； (2)帶毛囊的毛發：用70%己醇洗帶毛囊的毛發1次，后再用蒸饋水沖洗毛發2次。在 1.5ml EP管中分別放入2~4根毛發，毛囊置于EP管底部，用干凈的剪刀剪去毛發高于EP 管的部分； (3) 口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必須讓被收集者漱口。W除去口腔中過多的老 化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質。半小時內不要喝水、進食、吸煙，然后開始收集口 腔粘膜刮片或唾液，可視條件選擇如下方法收集唾液樣本；①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細胞， 將約0. 1ml唾液直接吐進EP管內；②生理鹽水漱口，吐進EP管內，吸取PBS溶液至裝有通 過上述任一種方法收集的唾液樣本的EP管中，反復吹打后，12000rpm離屯、5min，除去上清， 重復該過程一次；⑨用棉拭子反復刮拭面頰內壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的綴子小 屯、撕去其外表面，放入EP管中；④將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈 的剪刀剪成大小約1cm2碎紙片置于EP管中。
[0009] 然后用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，利用鹽析法去除蛋白等 雜質，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水溶解后于-20°C保存備用。
[0010] 在本發明的實施方案中，引物設計的指導思想是，針對mtDNA T14502C位點存在的 位置相鄰近，擴增在一條片段上，故應設計3'末端與14502位點野生型T和14502位點突變 型C相對應的上游引物；針對14502位點設計3'末端分別與14502位點野生型T和14502 位點突變型C相對應的下游引物。（參照圖1) 本發明人針對特異性PCR擴增后（圖2)，mtDNAT14502C位點形成了酶切位點。酶切 位點是由mtDNAT14502C突變形成的，其中的限制性內切酶為化CI，其位點處為序列表中 的沈QIDN0:3、4 ; 用W上設計的引物，W相應的被檢測樣本的DM為模板，通過PCR擴增后分別獲得明亮 清晰的大小約216bp的恒定擴增帶，14502突變位點對應于擴增片段的第62位。
[0011] 在上述檢測線粒體基因Leber病突變的方法中，結合特異性PCR技術和酶切技術， 每份DNA樣本分別用特異性引物即引物F/R于PCR反應管中進行普通PCR擴增，然后進行 突變位點處的酶切，通過一次PCR便可在幾小時內檢出Leber病相關的mtDNA T14502C突 變。
[0012] 理論上，基因組DNA樣本經一次PCR反應，即體系中僅加入針對突變型位點 T14502C引物F/R后，加入針對突變位點新形成的限制性內切酶化C I進行酶切，就可進行 檢測。也就是說，同一基因組DNA樣本經一次PCR-酶切，從而使檢測結果更為準確、可信。
[0013] 本發明人還根據本發明中設計的引物序列，通過人工合成(委托生物公司）獲得引 物，并將引物按一定的比例混合，與提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標 本對照、陰性標本對照W及使用說明書組合起來，制成了用于體外檢測母系遺傳Leber病 線粒體基因mtDNAT14502C突變的試劑盒，使得樣本DNA提取、特異性PCR擴增和酶切可W 在試劑盒提供的試劑基礎上順利完成。其中，提取樣本DNA的試劑主要由細胞裂解液和溶 液I(主要成分是蛋白酶K)組成；PCR擴增反應試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、S蒸水和Taq酶，限制性內切酶包括限制性內切酶化CI。
[0014] 用本發明的方法及其制備的體外檢測Leber病相關的線粒體基因mtDNAT14502C 突變試劑盒具有W下特點： 1.傳統上獲得Leber病患者基因組DNA的方法是從血液中提取，每人大約需要3~ 5ml。該種采血方法給很多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區傳遞 樣本時存在一定的風險和麻煩。本發明運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本巧曰一 滴血)、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA。該方法不僅解決 了傳統上從Leber病患者血液中提取DNA的問題，