用玻璃覆蓋的生物學試劑的制備
【專利說明】用玻璃覆蓋的生物學試劑的制備
[0001] 本申請為分案申請，原申請的申請日為2007年9月13日，申請號為 200780034507. 7 (PCT/US2007/078376)，發明名稱為"用玻璃覆蓋的生物學試劑的制備"。
[0002] 香叉參考相關申請
[0003] 本申請要求2006年9月18日提交的美國臨時專利申請號60/845, 307和2007年 1月31日提交的60/887, 364(其公開內容W其全文并入本文作為參考）的優先權。 發明領域
[0004] 本發明設及生物學材料和試劑W玻璃狀、多孔狀態長期貶存。特別地，其設及使用 多孔板制備該些材料和試劑和其貶存的方法。
[00化]發巧背景
[0006] 少數生物學活性材料足夠穩定，從而它們可在室溫下進行分離、純化且然后在溶 液中貶存。一般地，將生物學試劑貶存在保持在4°c、-20°C或-70°c的甘油溶液中。可將它 們散裝（inbulk)貶存，然后在使用前與其他試劑組合。
[0007] 在制備用于生物學樣品的便利和有效的測試的試劑中，經常重要的是獲得均勻、 預估量（discreetamount)的干燥的化學滲合物。用于穩定生物學試劑的載體或填充物的 一種類型是形成玻璃的填充材料。將生物學試劑溶液并入形成玻璃的填充材料（所述材料 是水溶性或水溶脹性物質）。然后將它們干燥W產生固定和穩定生物學試劑的玻璃狀組合 物。關于用于穩定生物學試劑的形成玻璃的填充材料參見US5, 098, 893、US5, 200, 399和 US5,240,843。
[000引碳水化合物例如葡萄糖、庶糖、麥芽糖或麥芽=糖是重要的形成玻璃的物質組。可 使用其他多哲基化合物例如碳水化合物衍生物如山梨糖醇和經化學修飾的碳水化合物。另 一類重要的形成玻璃的物質是合成的聚合物，如聚己締化咯燒酬、聚丙締酷胺或聚己締亞 胺。
[0009] 形成玻璃的物質的另外的實例包括糖類共聚物例如由GEHealthcare在注冊商標 FICDLL?下銷售的那些糖類共聚物。FICO^ ?具有5, 000至1，000, 000的分子量且包含通 過離橋鍵與雙功能基團連接的庶糖殘基扣S3, 300, 474)。此種基團可W是2、3或更多個碳 原子但通常不超過10個碳原子的亞烷基。雙功能基團用于將糖殘基連接在一起。此種聚 合物可W例如通過糖與面代醇或雙環氧（bis-epoxy)化合物的反應來制備。
[0010] 碳水化合物聚合物的玻璃狀基質中的經穩定的生物學材料可W通過冷凍干燥 (Treml等人US5, 593, 824;化anks和Hatl巧US5, 098, 893)或通過真空干燥CWa化er等 人US5, 565, 318)來制備。該些水溶性試劑方便地用于復雜的分子生物學應用。該方法具 體用于由W單次使用的等分試樣分配的酶、核巧酸和其他組分組成的試劑系統。玻璃狀基 質的重建遞送用于應用（包括DNA擴增和DNA測序）的經緩沖的酶。
[0011] 目前在市場上存在許多干燥的分子生物學產品。然而，該些產品中的一些通過相 當麻煩且包括大量的手工勞動的方法來制備。其他產品當干燥時需要冷凍。存在對用于產 生環境溫度干燥的試劑的改進方法的需要。
[00。]發巧概巧
[0013] 在本發明的第一方面，提供了產生干燥的試劑制劑的方法。該方法包括步驟；提供 至少一種經緩沖的生物學試劑的水溶液；將形成玻璃的填充材料與經緩沖的試劑溶液混合 來形成其中填充材料的濃度足W促進玻璃狀多孔組合物形成的混合物；將預先確定量的混 合物分配入多孔容器的孔；將容器中的混合物干燥W形成干燥的試劑制劑；其中所述試劑 制劑是水溶性的且具有對于室溫穩定性是足夠的Tg。混合物優選是均一的溶液。
[0014] 在本發明的一個實施方案中，將干燥的試劑制劑收集入試劑瓶中W用于延長的室 溫貶存。
[0015] 在本發明的另一個實施方案中，將干燥的試劑貶存于多孔容器中W進行延長的貶 存，用密封帶密封容器的頂部。任選地，密封帶是熱激活的。
[0016] 根據本發明的多孔容器可W是二氧化娃塑模（silicamould)或聚苯己締板。當 多孔容器是聚苯己締板時，本發明還包括在凍干前將聚苯己締板置于金屬塑模上，從而各 聚苯己締板孔的外壁與所述金屬塑模的孔緊密接觸W進行有效的熱傳遞。我們發現該改進 了干燥方法且產生了具有提高的完整性的干燥的試劑。
[0017] 在本發明的另一個方面，本發明提供了根據上述方法制備的干燥的生物學試劑組 合物。
[0018] 根據本發明制備的試劑組合物是水溶性的且具有對于持室溫穩定性是足夠的Tg。 優選地，試劑組合物具有結構完整性。
[0019] 生物學試劑組合物能夠在短于1分鐘，優選30秒內完全溶解在25y1水溶液中。 試劑組合物優選具有低于10%的含濕量。
[0020] 試劑組合物可具有至少一種當于室溫下在水溶液中單獨存在時不穩定的試劑。試 劑組合物還可包含多種當在室溫下于水溶液中存在時相互之間可W反應或可W不反應的 試劑。
[0021] 因此，本發明的目的和優點是提供干燥的生物學試劑組合物和產生所述組合物的 方法。
[0022] 根據下列描述，本發明的該些和其他目的W及優點將變得顯而易見。然而，該描述 僅僅是優選實施方案。因此，應當依賴權利要求來估計本發明的整個范圍。
[002引 附圖描巧
[0024] 圖1顯示用于按照本發明的實施方案制備干燥的試劑制劑的方法的方法工作流 程。
[0025] 圖2顯示，從左上角開始；用于按照本發明的實施方案制備干燥的試劑制劑的方 法的384孔聚苯己締板；右上角：顯示具有1千萬拷貝至1000拷貝的起始濃度的不同量的 入DNA作為模板的標準曲線，包括無模板對照；左下角：從384孔聚苯己締板制備的貶存在 塑料瓶中的干燥的試劑制劑餅/立方塊（cube);右下角：顯示干燥的試劑制劑成功地用于 入DNA實時qPCR擴增反應的擴增圖。
[0026] 圖3顯示，從左上角開始；用于按照本發明的實施方案制備干燥的試劑制劑的方 法的96孔二氧化娃塑模；右上角：顯示具有1千萬個拷貝至1000個拷貝的起始濃度的不同 量的ADNA作為模板的標準曲線，包括無模板的對照；左下角：從96孔二氧化娃塑模制備 的貶存在塑料瓶中的干燥的試劑片劑；右下角：顯示干燥的試劑制劑成功地用于ADNA實 時qPCR擴增反應的擴增圖。
[0027] 圖4顯示包含PCR制劑的96孔PCR板在凍干前進入金屬支架（metalholder)。
[0028] 圖5顯示不同形式的按照本發明的的實施方案制備的室溫穩定的PCR試劑。左上 角；瓶中的干燥的PCR混合物。右上角；96孔板中的干燥的PCR混合物。左下角；384孔板 中的干燥的PCR混合物。右下角；96孔穿孔板（perforatedplate)中的干燥的PCR混合 物。
[0029] 圖6顯示按照本發明的實施方案制備的干燥的PCR試劑的穩定性。干燥的PCR混 合物用于ADNA的qPCR。對于（1)'濕'制劑珠混合物（左上方）、（2)使用當前規程制備 的干燥的餅（右上方）和（3)來自GEHealthcare的puRetaqRead廠T〇-Go?(RTG)PCR珠 (左下方），注意到相似的性能。右下方；一式S份進行的上述S個反應的Ct值和PCR效 率。新形式和pureTaq珠的Ct值和PCR效率值是相當的。
[0030] 圖7顯示按照本發明的實施方案制備的干燥的PCR試劑的穩定性。將干燥的PCR 混合物于40°C和室溫（RT)下貶存8天。將干燥的試劑用于ADNA的qPCR，具有相似的性 能。左上角：于RT下貶存的干燥的PCR試劑餅（reagentcake)。右上角：于40°C下貶存 的干燥的PCR試劑餅。左下角；于RT下貶存的puReTaq珠（GEHealthcare)。右下角；于 40°C下貶存的puReTaq珠。
[0031] 圖8顯示一式兩份進行的上述四個反應的Ct值和PCR效率。當前形式和pureTaq 珠的Ct值和PCR效率值在4