一種測定顆粒及薄膜表面對水溶性蛋白非特異吸附的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術，設及測定顆粒及薄膜類材料對水溶性蛋白非特異吸附的方 法，尤其W水溶性顯色底物的水溶性水解酶為模型測定材料表面非特異吸附的的方法。
【背景技術】
[0002] 顆粒及薄膜類材料有重要的生物醫藥應用，但該些材料表面非特異吸附應盡可能 低；在制備過程中需快速簡便定量測定該些材料表面對水溶性蛋白非特異性吸附，W優化 表面修飾和功能化過程，該就需要簡便實用方法測定材料表面對水溶性蛋白的非特異吸 附。
[0003] 此前報道的方法采用標記信號修飾作為測試模型的水溶性蛋白，吸附反應后分離 出待測試材料測定其所攜帶的標記信號強度表征其非特異吸附。標記過程可能改變所選水 溶性模型蛋白的非特異性吸附性能，而且標記造成額外成本，標記信號的測定仍費時費力。
[0004] 使用未經修飾水溶性蛋白為模型直接測定其在待測試材料表面非特異吸附無疑 更好。該就需要篩選適合的水溶性蛋白模型，并建立對應的簡單適用定量方法。使用顯色 底物測定水解酶或辣根過氧化物酶的活性可用光度計或微孔板讀數器進行測定，所需樣品 量很少而成本低。因此，水溶性的水解酶及水溶性好的辣根過氧化物酶是候選模型蛋白的 代表。
[0005] 常用的生物醫藥材料大多含有金屬離子，如磁性顆粒常含有四氧化=鐵。該些無 機成分可能顯著干擾模型蛋白的酶活性而妨礙測定；辣根過氧化物酶的活性就受到鐵離子 等過渡金屬離子的顯著干擾。多數水解酶對常見金屬離子有抗性。所W，用水解酶為模型 測定顆粒及薄膜表面非特異吸附更合適。
[0006] 用水溶性酶蛋白為模型要求所用顯色底物有較好水溶性、對應顯色產物便于用酶 標儀類微孔板讀數器快速高通量測定、成本盡量低。篩選發現非特異磯酸酶、非特異芳香硫 酸醋酶的顯色底物滿足要求。因此，需要水溶性好的磯酸酶和芳香硫酸醋酶為模型。
[0007] 作為模型蛋白，水溶性水解酶吸附在常見顆粒及薄膜表面后需盡可能保留其活 性，才能保障測定的靈敏度。如非特異吸附在材料表面的水解酶活性升高則測定靈敏度更 高。經過篩選，發現牛小腸粘膜堿性磯酸酶CIAP、截去膜定位膚段的大腸桿菌堿性磯酸酶 ECAP及其突變體R168K、綠脈桿菌芳香硫酸醋酶PAAS、蝸牛芳香硫酸醋酶都適合。
[000引因此，W非特異磯酸酶和非特異硫酸醋酶為模型蛋白測定材料表面非特異吸附。
【發明內容】
[0009] 一種測定顆粒及薄膜表面對水溶性蛋白非特異吸附的方法，其特征在于： (一）W天然或重組表達的水溶性非特異磯酸醋酶、非特異硫酸醋酶為模型蛋白；此 類模型蛋白的代表是牛小腸粘膜堿性磯酸酶、截去膜定位膚段后重組表達的大腸桿菌堿性 磯酸酶、綠脈桿菌芳香硫酸醋酶、蝸牛芳香硫酸醋酶，W及重組表達的該些酶的突變體； (二） 用顆粒或薄膜類待測試材料，在設定吸附條件下與模型蛋白進行吸附反應： (1) 設定吸附條件代表是抑在6. 0到8. 0之間、溫度在攝氏4到37度之間；代表性緩 沖液包括哲己基嗽嗦己橫酸緩沖液、3-嗎咐丙橫酸緩沖液、2-(N-嗎咐代）己橫酸緩沖液； (2)模型蛋白的所選濃度水平據需模擬的條件確定，代表水平在0.05 mg/L到5.0 g/ L之間； (S)分離吸附了模型蛋白的待測試材料，溫和洗漆，測定被吸附模型蛋白的酶活性： (1) 用適當的物理方法分離出微納米顆粒或薄膜；分離磁性顆粒適當的物理方法包括 外部磁力及離屯、，分離密度較大無機及無機-有機復合顆粒適當的物理方法包括離屯、，分 離薄膜適當的物理方法包括機械器械輔助的手工分離方法； (2) 溫和洗漆；用吸附反應緩沖液溫和洗漆吸附了模型蛋白的顆粒及薄膜； (3) 被吸附模型蛋白的催化反應：測定磯酸醋酶活性所用顯色底物代表為對硝基苯基 磯酸醋和4-硝基-1-蒙基磯酸醋、測定硫酸醋酶活性所用顯色底物代表為對硝基苯基硫酸 醋和4-硝基-1-蒙基硫酸醋；測定活性所用緩沖液的代表是模型蛋白發揮酶活性的最適緩 沖液，所用顯色底物濃度在0. 05到50ml之間，測定溫度在攝氏20到37度之間；反應時 間的代表在3. 0到60分鐘之間，并根據被吸附模型蛋白的酶活性的高低調整； (4) 終止被吸附模型蛋白的酶反應；如被吸附酶活性很高，在反應設定時間后加入氨 氧化鋼類強堿的高濃度溶液，快速混勻將反應體系抑提高到抑12W上終止反應，再用適 當物理方法除去待測試材料；如被吸附酶活性很低，當所設定反應時間長于30分鐘時，直 接用適當物理方法分離除去待測試材料而終止反應；如待測試材料在強堿處理后變化而干 擾測定顯色產物吸收，用適當物理方法除去待測試材料終止反應；如所用模型蛋白酶活性 最適抑低于抑7. 0且用物理方法終止了酶反應，則再加強堿將抑調節到抑8. 0W上； (5) 用光度計測定吸附酶反應混合物上清液的吸收；顯色產物為對硝基苯酪時測定波 長在405nm附近，顯色產物為4-硝基-1-蒙酪則測定波長在460nm附近； (四）W吸附反應所用模型蛋白總量對應酶活性為基數，吸附在待測試材料表面的酶 活性活性所占比例為吸附率，表示所測試材料對模型蛋白的非特異吸附性能。
[0010] 應用實施例 所用材料制備、試劑來源 總蛋白濃度用化a壯ord方法測定。每分鐘生成1微摩爾顯色產物對硝基苯酪的酶量 為一個單位。對硝基苯基磯酸二鋼PNPP、對硝基苯基硫酸鋼4WS都來自Sigma-al化ich。 大腸桿菌堿性磯酸酶6〔4?的重組表達和純化見文獻[//?^ /&'07 2015; 74: 211-217];所得ECAP比活性約100kU/g。綠脈桿菌芳香硫酸醋酶PAAS編碼序列見GI: 879288 ;在N端加SNSNSN連接片段再加細is標簽；編碼序列委托北京泰和基因全合成，插 入祀T24a表達載體；在大腸桿菌化21 (DE3)中攝氏16度用異丙基-beta-護半乳糖巧誘導 表達18小時，收集細胞，超聲裂解離屯、得上清液進Ni"-NTA柱純化兩遍，所得PAAS活性約 36kU/g。
[OCm]ECAP活性測定：含底物緩沖液為1. 0 M二己醇胺-HCl緩沖液，pH10. 0,底物PNPP終濃度10. 0ml,MgCls終濃度2.0ml。測定吸附在磁珠上的磯酸酶活性時，反應體系共加 入含底物的緩沖液0. 20ml;反應指定時間后加入10ul濃度為10. 0M的氨氧化鋼溶液終 止反應，快速磁分離去掉磁珠，用Biotek ELX800酶標儀測定吸收。
[001引PAAS活性測定：含底物緩沖液為1. 0M二己醇胺-HC1緩沖液，pH10. 0,底物4NPS 終濃度1. 0ml。測定吸附在磁珠上的PAAS活性時，反應體系共加入含底物的緩沖液0. 20ml;反應指定時間后加入10ul濃度為10.0M的氨氧化鋼溶液終止反應，快速磁分離去掉 磁珠，用BiotekELX800酶標儀測定吸收。
[0013] 待測試磁珠；制備兩種亞微米磁珠MSP。第一種為用陽G衍生物為單體聚合制 備，詳細過程見[估^ 2013，8:791-807]及中國發明專利化201210046309. 5
[授權日期2014-09-24];所得磁珠用MSP-PEG表示。第二種磁珠參照文獻[化 公如餅俗1998; 60(4):419-4