一種以cyp2e1為靶點的藥物篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種以CYP2E1為靶點的藥物篩選方法。
【背景技術】
[0002]細胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)是一類能夠與重金屬結合的配體，形成的酶在生物細胞通過可逆性的變化而進行電子傳遞。CYP450于1995年從哺乳動物肝臟的微粒體中發現的，隨后在包括昆蟲、細菌到高等動物均有發現。CYP450參與催化許多生物過程并引起了專家和學者的廣泛關注。
[0003]CYP2E1在許多疾病和生理病理狀態下發揮重要作用，并且能夠影響致癌作用和藥物的療效。CYP2E1能夠催化外源性物質的生物轉化，包括藥物及毒性物質，如對乙酰氨基酚，揮發性麻醉藥(安氟醚，異氟烷，三氟溴氯乙烷)，乙醇以及工業溶劑和化學物質(前致癌物質)。另外，CYP2E1也參與內源性物質的生物轉化，如酮體，甘油和不同的脂肪酸。然而，CYP2E1同樣能夠代謝藥物和有毒物質產生有害的活性代謝產物。例如，CYP2E1將對乙酰氨基酚代謝為N-乙酰基對苯醌亞胺，從而誘導氧化應激，線粒體功能喪失和細胞死亡。不僅如此，CYP2E1產生活性氧(ROS)，可以破壞細胞和線粒體，包括線粒體DNA和細胞色素C氧化酶在內的組分。CYP2E1的重要特征之一是可以被不同的小分子有機化合物所誘導，如酒精，吡唑，丙酮或異煙肼等。事實上，酒精誘導CYP2E1是通過抑制其自身降解增強CYP2E1蛋白穩定性及激活CYP2E1轉錄基因增加其蛋白濃度。因此，在酒精中毒時，肝臟中CYP2E1的含量會顯著升高。
[0004]目前研宄認為，在不同的生理病理狀態下均能夠提高CYP2E1的mRNA或蛋白的表達，包括肥胖，禁食，II型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病。通過提高CYP2E1的表達從而導致肥胖，糖尿病或非酒精性脂肪肝病的機制目前仍有爭議。在這些病人中，CYP2E1的誘導能夠導致肝臟的生酮作用。近期報道稱，肝CYP2E1的誘導可以證實與系統性胰島素抵抗，肝胰島素信號消減和肝脂肪堆積提高緊密相關。除升高的酮體和胰島素抵抗，其他因素如肝中脂肪過量堆積或脂肪因子(脂聯素，瘦素，等)的分泌也可能是引起肥胖患者CYP2E1表達/活性升高的重要原因。CYP2E1在健康人群和肥胖/糖尿病人中均可產生ROS和活性代謝產物，從而使機體對藥物和有毒物質更加敏感。因為線粒體內CYP2E1可以代謝產生大量的有毒物質，從而導致線粒體損傷和功能障礙，最終誘導細胞凋亡產生肝硬化和細胞凋亡。因此，CYP2E1在疾病的發生和藥物代謝中發揮重要作用。
[0005]目前，針對CYP2E1的藥物篩選局限于其抑制劑的篩選。提取肝臟微粒體，將藥物加入到含底物(4-硝基苯酚)，NADPH生成系統，6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶的磷酸鉀緩沖液中，檢測CYP2E1的活性，從而篩選出CYP2E1的抑制劑。但此方法存在局限性:I)肝臟微粒體的提取條件要求苛刻:需要超高速低溫離心機；2)提取的微粒體蛋白含量少且易失活:超高速離心得到微粒體蛋白會緊密的形成一團，在微粒體蛋白吹打溶解的過程中容易產生氣泡從而氧化失活；3)對CYP2E1誘導劑的篩選無效:微粒體蛋白提取后質量不會增加，誘導劑不能增加CYP2E1的總量；4)藥物干擾:檢測CYP2E1活性是采用分光光度法在A535nm處檢測Img蛋白在15min內CYP2E1代謝產物(4-硝基兒茶酚)的生成含量計算，某些藥物在A535nm也有吸收峰會對CYP2E1活性的檢測形成干擾。
[0006]鑒于微粒體以上不足，線粒體成為本方法的靶器官。CYP2E1定位于線粒體的證據，于1997年，Avadhani課題組用抗體蛋白直接識別線粒體內CYP2E1第一次發現CYP2E1在線粒體內的存在，隨后電鏡實驗證明免疫膠體金標記CYP2E1同樣存在于線粒體內膜上。隨后，從大鼠肝線粒體純化出線粒體蛋白，鑒定全長的CYP2E1，并研宄其分子性質和酶活性。酒精和吡唑是CYP2E1的誘導劑，在吡唑處理的大鼠的肝臟中，線粒體CYP2E1占肝組織總CYP2E1的40%，并且線粒體中CYP2E1的磷酸化高于內質網線粒體。AMLD1-TOF分析法和氨基端氨基酸測序法證明大鼠肝線粒體CYP2E1與微粒體CYP2E1有共同的氨基酸序列。線粒體和微粒體內CYP2E1的結構大部分是相同的，無明顯差異。在人和大鼠的腦線粒體中也發現CYP2E1的存在。有趣的是，CYP2E1依賴的單氧化酶N-nitrosodim-ethylamine-N-demethylase在腦線粒體中的活性是微粒體中活性的兩倍。因此，與微粒體CYP2E1相比，線粒體CYP2E1結構無差異，但活性CYP2E1的含量卻明顯高于內質網含量。
[0007]目前，正對CYP2E1的藥物篩選模型多以藥物與微粒體共孵育從而檢測CYP2E1的活性，篩選出CYP2E1的抑制劑。利用這種方法只能篩選CYP2E1的抑制劑，而不能對其誘導劑進行有效的篩選，具有局限性；微粒體的提取需要超高速低溫離心機，且提取量相對較少，條件相對比較苛刻。本研宄建立有活性的肝勻漿孵育體系能夠有效的篩選鑒于CYP2E1在不同物種的不同組織器官分布的廣泛性、對機體生理病理調控的重要性及對藥物代謝催化的高效性，有必要針對CYP2E1建立一種簡單有效的藥物篩選方法。
【發明內容】
[0008]發明目的:本發明針對上述現有技術存在的問題做出改進，即本發明公開了一種簡單有效的針對CYP2E1為靶點的藥物篩選方法，以便篩選出CYP2E1的誘導劑和抑制劑，從而為藥物的體內及藥物間相互作用的預測提供依據。
[0009]技術方案:一種以CYP2E1為靶點的藥物篩選方法，包括如下步驟:
[0010]SI獲取動物的新鮮組織并剪碎，然后加入緩沖溶液進行至少一次的勻漿，直至漿料為粉紅色均一的組織混懸液為止，得到生物活性勻漿孵育體系；
[0011]S2將所需檢測的藥物進行稀釋成10,?10 ^mg/mL后，再按照需檢測的藥物:生物活性勻漿孵育體系=I: 10的體積比將需檢測的藥物加入到步驟SI所得的生物活性勻漿孵育體系中進行孵育；
[0012]S3對S2所得的生物活性均勻漿孵育體系進行二次勻漿，待所述生物活性均勻漿孵育體系與藥物作用結合后，通過提取生物活性均勻漿孵育體系的線粒體方式提取所述生物活性均勻漿孵育體系的CYP2E1 ；
[0013]S4檢測步驟S3的線粒體中CYP2E1的表達和活性。
[0014]需要說明的是，步驟SI中，選用的緩沖溶液為TMS buffer或線粒體提取液，所述線粒體提取液由蔗糖、EDTAJP Tris-HCl(pH 7.4)等按比例配制而成的。
[0015]需要說明的是，步驟SI中，剪碎后的動物新鮮組織與緩沖溶液液的稀釋質量比為
1:10ο
[0016]需要說明的是，步驟SI中，勻漿速度為1.0?2.5rpm。
[0017]需要說明的是，步驟SI中，動物包括但不限于家禽、大鼠和小鼠中的一種，而動物新鮮組織則包括但不限于肝臟、脾臟、腎、腦、心臟和腸道中的一種。
[0018]需要說明的是，步驟SI中，每次勻漿均在(TC的冰水混合物中進行。以保證肝勻漿孵育體系的生物活性。
[0019]需要說明的是，步驟S2中孵育條件為:在0°C的冰水混合物中孵育15?30分鐘。
[0020]需要說明的是，步驟S4中，具體采用Western blot的方法檢測CYP2E1的表達，用底物反應法檢測CYP2E1的活性。如此有助于從量和活性的雙重角度評價藥物對CYP2E1的影響。
[0021]有益效果:本發明公開了一種以CYP2E1為靶點的藥物篩選方法具有以下有益效果:
[0022]1、所提供的方法不再局限于篩選CYP2E1抑制劑，而是能夠篩選CYP2E1抑制劑和誘導劑；
[0023]2、方法簡單，比現有的方法更加容易操作和省時；
[0024]3、本發明選擇提取線粒體以進行CYP2E1的提取，與傳統的提取微粒體相比能更高效地獲得活性CYP2E1 ；
[0025]4、避免藥物干擾，且更接近生理狀態，更能反映體內實際效果；
[0026]6、節省實驗動物；
[0027]7、與體內實驗相比，縮短實驗周期；
[0028]8、采用Western blot的方法檢測CYP2E1和藥物作用后的表達，用底物反應法檢測CYP2E1的活性，同時反映了 CYP2E1表達和活性的變化。
【具體實施方式】
:
[0029]下面對本發明的【具體實施方式】詳細說明。
[0030]具體實施例1
[0031 ] 一種以CYP2E1為靶點的藥物篩選方法，包括如下步驟:
[0032]SI獲取動物的新鮮組織并剪碎，然后加入緩沖溶液進行至少一次的勻漿，直至漿料為粉紅色均一的組織混懸液為止，得到生物活性勻漿孵育體系；
[0033]S2將所需檢測的藥物進行稀釋成10_1(lmg/mL后，再按照需檢測的藥物:生物活性勻漿孵育體系=I: 10的體積比將需檢測的藥物加入到步驟SI所得的生物活性勻漿孵育體系中進行孵育；
[0034]S3對S2所得的生物活性均勻漿孵育體系進行二次勻漿，待生物活性均勻漿孵育體系與藥物作用結合后，通過提取生物活性均勻漿孵育體系的線粒體方式提取生物活性均勻漿孵育體系的CYP2E1 ；
[0035]S4檢測步驟S3的線粒體中CYP2E1的表達和活性。
[0036]本實施例中，步驟SI中，選用的緩沖溶液為TMS buffer ο
[0037]本實施例中，步驟SI中，剪碎后的動物新鮮組織與緩沖溶液液的稀釋質量比為
1:10ο
[0038]本實施例中，步驟SI中，勻漿速度為l.0rpm。
[0039]本實施例中，步驟SI中，動物為家禽，動物新鮮組織則為肝臟。
[0040]本實施例中，步驟SI中，每次勻漿均在0°C的冰水混合物中進行。以保證肝勻漿孵育體系的生物活性。
[0041]本實施例中，步驟S2中孵育條件為:在0°C的冰水混合物中孵育15?30分鐘。
[0042]本實施例中，步驟S4中，具體采用Western blot的方法檢測CYP2E1的表達，用底物反應法檢測CYP2