一種蟲草素發酵固體培養基及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種蟲草素發酵固體培養基及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]蟲草素是蟲草中主要的活性成分之一。蟲草素具有多種生物學活性，如抗腫瘤、抗增殖、抗轉移、抗菌、抗病毒、免疫調節和抗炎等。蟲草素的制備主要有化學合成和生物合成兩種方式。由于目前化學合成蟲草素生產成本高，合成工藝復雜，收率低，產物純化比較難，所以蟲草素主要由生物合成法制備。生物合成法制備蟲草素有兩種途徑:一是固體發酵獲得蟲草子實體，再從中提取；二是通過蟲草液體發酵，從發酵液中直接提取。由于液體發酵比固體發酵在發酵規模、菌體生長速率、生長密度以及可控性上的優勢，蟲草液體發酵提取蟲草素成為主要的蟲草素制備方法。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種可產生大量子實體的蟲草素發酵固體培養基。
[0004]本發明還要解決的技術問題是提供上述固體培養基的制備方法。
[0005]本發明最后要解決的技術問題是提供上述固體培養基的應用。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0007]一種蟲草素發酵固體培養基的制備方法，它包括如下步驟:
[0008]I)將葡萄糖40?50g/L，酵母膏3?10g/L，蛋白胨5?15g/L，磷酸二氫鉀0.2?1.0g/L，磷酸氫二鉀0.2?L Og/L，硫酸鎂0.2?L Og/L，吐溫80 0.5?5.0g/L，溶劑為水，充分攪拌溶解后調節溶液pH值5.5?6.0，制得發酵培養液；
[0009]2)將步驟I)中的發酵培養液與膨脹珍珠巖混合均勻，經噴霧干燥后裝入發酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲草素發酵固體培養基。
[0010]步驟I)中，將葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫802g/L，溶劑為水，充分攪拌溶解后調節溶液pH值5.8，制得發酵培養液。
[0011 ] 步驟2)中，所述的膨脹珍珠巖粒徑為4?8mm，優選6mm。
[0012]步驟2)中，發酵培養液與膨脹珍珠巖的體積質量比為30?50ml/g，優選40ml/g。
[0013]步驟2)中，噴霧干燥后的物料含水量控制在2.5-5ml/g，優選4ml/g。
[0014]上述制備方法制備得到的蟲草素發酵固體培養基也在本發明的保護范圍之內。
[0015]上述蟲草素發酵固體培養基在發酵生產蟲草素中的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0016]具體的應用方法是，將在PDA斜面培養基上長好的蛹蟲草菌種用5ml無菌生理鹽水洗下，制成菌懸液，接種至滅菌好的裝有50ml的發酵培養液搖瓶中，于27°C，ISOrpm恒溫搖床培養4天，加入無菌水450ml，混合均勻后，再以Iwt %接種至滅菌好的蟲草素發酵固體培養基中，充分攪拌使菌種均勻分布于蟲草素發酵固體培養基中，每24h時以lwt%比例補水維持相對濕度，并攪拌翻料，同時從發酵罐底部通入相對濕度為80%的無菌空氣，通氣比為0.SmirT1，27°C培養4天后，通氣比降為0.51Γ1，每5天以5wt%噴淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和2?6g/L(優選4g/L)三油酸甘油酯的培養液使其產生大量的子實體，其余條件不變，再培養21天后發酵結束；加入1.5倍固料體積的水，80°C攪拌翻料2h，過濾收集濾液；水煮過程進行三次，合并濾液，濃縮至固料體積，得到蟲草素提取液。
[0017]上述蛹蟲草菌種為任意具有蟲草素生產能力的蛹蟲草菌種，例如可以是購買自中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC 14014的菌株。
[0018]本技術通過培養液在20目膨脹珍珠巖上的吸附，發揮固體發酵的優勢，克服其缺陷，利用20目膨脹珍珠巖中豐富的比表面積達到大量生產子實體的目的。眾所周知，蟲草素通常富集于蛹蟲草子實體頂部。
[0019]我們通過文獻調研和研宄發現蟲草素的直接前體是腺嘌呤，而蟲草素的另一個結構單元是3’ -脫氧核糖。在蛹蟲草發酵中，我們發現在發酵培養基中加入腺嘌呤能大大提高蟲草素產量。而且，我們還發現加入植物油后蛹蟲草發酵液中的蟲草素含量又有進一步升尚O
[0020]蛹蟲草傳統培養方法是應用葡萄糖、蛋白胨和酵母膏為主要成分的發酵培養基。這些成分只能滿足蛹蟲草基本的生長和發育需要，蟲草素產量較低。而加入腺嘌呤后提供了一定的蟲草素前體，使得蟲草素產量有所提高。但是3’ -脫氧核糖單元是通過脂肪酸代謝途徑，經乙酰CoA，再經過次級代謝途徑合成的，這與先前理解的3’ -脫氧核糖是通過磷酸戊糖途徑合成的有差別。因此，在缺乏乙酰CoA供給的條件下，蟲草素含量很難再提高。而植物油等甘油酯在蛹蟲草中通過脂肪酸代謝能夠分解為大量的乙酰CoA，進而能夠進一步提高蟲草素的產量。
[0021]本發明的有益效果:
[0022]1、本發明所采用的20目膨脹珍珠巖作為支持介質，其比表面積為10m2/g(內徑為10米的發酵罐，在非攪拌條件下氣液界面僅為78.5m2，僅相當于8g20目膨脹珍珠巖)，孔隙率達到50-90%，這些有利于傳質及子實體生長和孢子的產生，同步性佳。
[0023]2、根據蛹蟲草菌體生長和蟲草素積累所需的不同供氧條件，利用通氣比來改變，影響因素少，更簡單方便。
[0024]3、本發明加入腺嘌呤和三油酸甘油酯，提供蟲草素的兩種前體，更有利于蟲草素的積累。
【附圖說明】
[0025]圖1為不同培養基對蟲草素含量的影響圖，其中橫坐標I為實施例4，2為實施例5，3為實施例6，4為對比例1，5為對比例2，縱坐標代表測得的發酵液或蟲草素提取液中蟲草素含量。
[0026]圖2為不同培養基對子實體濃度的影響圖，其中橫坐標I為實施例4，2為實施例5，3為實施例6，4為對比例1，5為對比例2，縱坐標代表測得的子實體濃度。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0028]若未特別指明，以下實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0029]實施例1:蛹蟲草發酵固體培養基制備。
[0030]I)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫80 2g/L，溶劑為水，充分攪拌溶解后調節溶液pH值5.8，制得發酵培養液。
[0031]2)將步驟I)中的發酵培養液與粒徑6mm的膨脹珍珠巖按照體積質量比為40ml/g混合攪拌，經噴霧干燥后，物料含水量控制在4ml/g裝入發酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲草素發酵固體培養基。
[0032]實施例2:蛹蟲草發酵培養基制備。
[0033]I)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫80 2g/L，溶劑為水，充分攪拌溶解后調節溶液pH值5.8，制得發酵培養液。
[0034]2)將步驟I)中的發酵培養液與粒徑4mm的膨脹珍珠巖按照體積質量比為30ml/g混合攪拌，經噴霧干燥后，物料含水量控制在5ml/g裝入發酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲草素發酵固體培養基。
[0035]實施例3:蛹蟲草發酵培養基制備。
[0036]I)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫80 2g/L，溶劑為水，充分攪拌溶解后調節溶液pH值5.8，制得發酵培養液。
[0037]2)將步驟I)中的發酵培養液與粒徑8mm的膨脹珍珠巖按照體積質量比為50ml/g混合攪拌，經噴霧干燥后，物料含水量控制在2.5ml/g裝入發酵罐，121°C蒸汽滅菌20min，獲得蟲草素發酵固體培養基。
[0038]實施例4:蛹蟲草固體發酵培養基在提高蛹蟲草蟲草素產量上的應用。
[0039]1、從中國工業微生物菌種保藏管理中心購買的蛹蟲草菌種(編號:CICC14014)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態，在實驗之前需要恢復菌種活性。在超凈工作臺中，用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，使安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端，加入0.5ml 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0.2ml菌體懸浮液加至斜面培養基中，25 °C恒溫培養7d。
[0040]2、將在PDA斜面培養基上長好的菌種用5ml無菌生理鹽水洗下，制成菌懸液，接種至滅菌好的裝有50ml的發酵培養液搖瓶中，于27°C，180rpm恒溫搖床培養4天，加入無菌水450ml，混合均勻后，再以Iwt %接種至滅菌好的實施例1固料培養基中，充分攪拌使菌種均勻分布于培養基中，每24h時以1被％比例補水維持適當的相對濕度，并攪拌翻料，同時從發酵罐底部通入相對濕度為80%的無菌空氣，通氣比為0.SmirT1JTO培養4天后，通氣比降為0.51Γ1，每5天以5wt%噴淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和4g/L三油酸甘油酯的培養液使其產生大量的子實體，其余條件不變，再培養21天后發酵結束。加入1.5倍固料體積的水，80°C攪拌翻料2h，過濾收集濾液。水煮過程進行三次，合并濾液，濃縮至固料體積，得到蟲草素提取液。
[0041]實施例5:蛹蟲草發酵培養基在提高蛹蟲草發酵液中蟲草素含量上的應用
[0042]1、從中國工業微生物菌種保藏管理中心購買的蛹蟲草菌種(編號:CICC14014)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態，在實驗之前需要恢復菌種活性。在超凈工作臺中，用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，使安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端，加入0.5ml 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0.2ml菌體懸浮液加至斜面培養基中，25 °C恒溫培養7d。