一種利用水生拉恩氏菌制備生物納米硒的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及屬于微生物應用與納米砸合成領域，具體地，涉及利用水生拉恩氏菌制備生物納米砸的方法。
【背景技術】
[0002]砸(Se)是動物和人類所必需的一種微量元素，與人體內抗氧化功能，甲狀腺激素代謝，和免疫系統等密不可分。缺砸會造成人類肌肉萎縮，心血管、骨骼或免疫系統疾病，增加癌癥的風險，但過量砸也會對人體產生毒害。然而，在我國砸的分布極不均勻，缺砸地區占有相當大的比例，迫切需要解決。目前，通過補食植物富砸產品的應用最為廣泛，其生產主要是依靠施用砸肥補充砸鹽，但砸鹽具有較高的毒性，會對環境帶來潛在風險。
[0003]據研宄納米材料可表現出新的特征，比如表面活性高，比表面積大，活性位點多，及較高的催化效率等，應用范圍廣泛。而納米砸作為一種有益的低毒元素逐漸成為研宄熱點，用納米砸作為抗氧化劑可以降低砸毒害風險，納米砸顆粒與C = O，COO和C-N組蛋白結合時會表現出重要的生物活性，可用于生物、化學、醫藥等領域，比如可以生產砸-維生素、食品添加劑、新型抗生素衣料，納米砸醫用材料以及在防治癌癥方面的應用等。納米砸還能夠抑制人類乳腺癌細胞(MCF-7)的生長以及致病菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生長。并且納米砸具有很好地光電學和半導體特性，已廣泛應用于太陽能電池、整流器、傳感器，靜電復印等光電元件。所以納米砸在工業、保健品產業及富砸農作物產業中具有極大地應用潛力。
[0004]納米砸通常通過化學反應，結晶技術，反向膠束法等技術生成，但這些技術會受到高溫、高壓、催化劑等條件限制，而且會對環境造成危害，生產的納米砸性質也不穩定。進而需要一種清潔，無毒，環保的方法來生產穩定的納米砸。
[0005]細菌對砸在自然界中的循環發揮著重要作用，尤其是根際促生菌(PGPR)可促進植物對砸的吸收。已發現許多細菌如如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum Molisch)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)等可將氧化態砸還原為無毒高效的紅色納米砸，而且這種納米砸性質穩定，活性高。由于細菌具有生長迅速、繁殖快、代謝能力強、適應性強等特點，所以利用微生物轉化砸不受季節和氣候的影響，生產周期短，故利用細菌合成生物納米砸被認為是一種高效砸的生物轉化和降低環境風險的解決方式之一。其中水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2具有很好的溶解磷作用，產生植物促生物質IAA和PQQ，同時能夠產生植物抗菌物質，對植物具有防病促生效果，目前還未見利用水生拉恩氏菌合成生物納米砸的報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種生物納米砸的制備方法。
[0007]本發明的另一個目的在于提供水生拉恩氏菌在制備生物納米砸中的用途。
[0008]本發明的生物納米砸的制備方法，是以砸酸鹽或亞砸酸鹽為原料，以水生拉恩氏菌為發酵菌，發酵生產生物納米砸。
[0009]本發明的生物納米砸的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)活化的水生拉恩氏菌接種于LB液體培養基中，加入砸酸鹽溶液；
[0011](2)振蕩培養。
[0012]本發明的生物納米砸的制備方法，還包括步驟(3)收集培養液，離心，沖洗沉淀，向沉淀中加入氫氧化鈉溶液，沸水浴，靜置至室溫，再加入正己烷溶液，靜置分層后取下層的紅色溶劑相。
[0013]其中步驟(3)中，離心條件為8000_12000r/min，離心5_15min ;向沉淀中加入IN氫氧化鈉溶液，沸水浴15-25min，再加入總溶液1/2體積的正己烷，攪拌均勻，靜置分層后取下層的紅色溶劑相。
[0014]優選地，離心條件為10000r/min，離心1min ;沸水浴20min。
[0015]本發明的上述方法，還包括步驟(4)用鹽酸調紅色溶劑相pH值7.5-7.0，離心去上清，重復操作多次后，將沉淀懸浮于去離子水中，得到生物納米砸懸浮液。
[0016]優選地，步驟(4)用鹽酸調紅色溶劑相pH值7.2。
[0017]進一步地，步驟(4)中，鹽酸濃度為6M，離心條件為8000-12000r/min，30min。
[0018]進一步地，本發明的生物納米砸制備方法中，步驟(I)的砸酸鹽為砸酸鈉或亞砸酸鹽為亞砸酸鈉；當為砸酸鈉時，其在LB液體培養基中的終濃度為50-575mM ;當為亞砸酸鈉時，其在LB液體培養基中的終濃度為5-75mM。
[0019]更進一步地，當為砸酸鈉時，其在LB液體培養基中的終濃度為80mM ;當為亞砸酸鈉時，其在LB液體培養基中的終濃度為15mM。
[0020]優選地，本發明方法中所用的水生拉恩氏菌為保藏編號為CGMCC N0.1896的水生拉恩氏菌HX2。該菌已于2006年12月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研宄所，簡稱CGMCC，郵編100101)保藏，分類命名為水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis。
[0021 ] 本發明的方法中，步驟⑵振蕩培養的條件為26-28 0C，160-200r/min,培養72-96ho
[0022]優選地，步驟(2)振蕩培養的條件為28°C，180r/min，培養72_96h。
[0023]本發明還提供了水生拉恩氏菌在制備生物納米砸中的應用。
[0024]本發明制備生物納米砸的方法清潔無毒，環保高效，合成的納米砸性質穩定，雜質少，粒徑均一，分散度好，可用于生產富砸產品。本發明方法彌補傳統方法生產納米砸及富砸產品方式的不足，從而達到環保高效的效果，可廣泛應用于富砸產品的開發等領域，同時該生物納米砸在工業、保健品產業應用潛力巨大，具有較好的經濟效益和社會效益。
【附圖說明】
[0025]圖1為不同濃度亞砸酸鈉對水生拉恩氏菌HX2菌的影響圖。
[0026]圖2為不同濃度砸酸鈉對水生拉恩氏菌HX2菌的影響；
[0027]圖3為添加15mM亞砸酸鈉所得納米砸與水生拉恩氏菌混合液檢測圖，其中圖3A為環境掃描電子顯微鏡(ESEM)照片，圖3B為透射電子顯微鏡(TEM)照片，圖3C為納米砸能譜(EDX)分析圖，箭頭所指為納米砸顆粒分析；
[0028]圖4為添加200mM砸酸鈉所得納米砸與水生拉恩氏菌混合液檢測圖，其中圖4A為環境掃描電子顯微鏡(ESEM)照片，圖4B為透射電子顯微鏡(TEM)照片，圖4C為納米砸能譜(EDX)分析圖，箭頭所指為納米砸顆粒分析；
[0029]圖5為分離純化所得生物納米砸顆粒透射電子顯微鏡(TEM)照片；
【具體實施方式】
[0030]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0031 ] 若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0032]實施例1水生拉恩氏菌對亞砸酸鈉(Na2SeO3)的耐受實驗
[0033]1、1^液體培養基為:似(:1 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，去離子水1L，121°C高壓滅菌20min。
[0034]LB固體培養基:NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，去離子水1L，分裝至10mL的三角瓶中(25mL/瓶)，121°C高壓滅菌20min。
[0035]分別向上述高壓滅菌后的LB固體培養基中加入提前過濾除菌的IM的亞砸酸鈉母液配制成以下濃度 OmM(CK)、60mM、70mM、75mM、85mM、95mM、105mM、115mM 的含亞砸酸鈉的 LB
培養基。
[0036]2、吸取100 μ L活化好的水生拉恩氏菌ΗΧ2菌液(OD6tltl= 0.8)，用0.85 %的生理鹽水梯度稀釋，最終得到稀釋度分別為10_3、10_4、10_5、10_6的菌液待用。
[0037]3、分別吸取2.5 μ L上述梯度(10_3、10_4、10_5、10_6)的菌液滴加到含不同砸濃度的平板上，每個梯度重復三次，待菌滴晾干后，將平板倒置于，28°C條件下靜置培養96h。
[0038]4、結果如圖1所示:培養96h后將平板取出觀察①顏色:60?115mM的7個處理中，稀釋度為10_3、10_4、10_5均有紅色菌落長出，當處理濃度高于75mM時，隨著處理濃度的增加，紅色顯著變淡單個菌落大小:當處理濃度高于75mM之后，各處理條件下單個菌落的尺寸相對于空白對照CK(不添加亞砸酸鈉的LB平板)明顯變小；③菌落個數:當稀釋度為10_5時，砸濃度為75mM的處理下的單菌落個數與空白對照CK的菌落個數之間具有顯著性差異(P〈0.05)。
[0039]5、最小抑制濃度的確定:綜合上述步驟4中的分析，得到亞砸酸