一種豬偽狂犬病病毒prv-yf株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及豬偽狂犬病病毒技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種豬偽狂犬病病毒PRV-YF株， 還設(shè)及豬偽狂犬病病毒PRV-YF株的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[000引 偽狂犬病毒（Pseudor油iesvirus,PRV)，屬于瘤疹病毒Ofepersviridae)a瘤 疹病毒亞科（Alpha-hepersririnae)水痘病毒屬（Varicellavirus)的瘤疹病毒I型 (PorcineherpesvirusTypel)，能引發(fā)豬的嚴(yán)重疾病。偽狂犬病常呈爆發(fā)性流行，對(duì)妊娠 母豬的危害尤其嚴(yán)重，常引起死胎、流產(chǎn)、木乃伊胎；后備母豬和空懷母豬感染病毒后可引 起不育癥，不發(fā)情、返情和屢配不孕。公豬感染后表現(xiàn)為睪丸腫脹、萎縮，失去種用能力。新 生仔豬感染PRV后大量死亡，15日齡W內(nèi)死亡率可達(dá)100%，3~4周齡仔豬的死亡率可達(dá) 30%~40%。育肥豬感染偽狂犬病病毒后，則表現(xiàn)為發(fā)熱，呼吸道癥狀W及生長遲緩，影響 增重，降低飼料報(bào)酬。同時(shí)，豬既是偽狂犬病毒的貶存者，也是偽狂犬病毒的傳染源，控制豬 偽狂犬病不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)本身，而且對(duì)其它動(dòng)物養(yǎng)殖的順利發(fā)展也有著十分重要的意義。疫 苗免疫接種是預(yù)防控制與消滅偽狂犬病的根本措施。目前市售的PRV疫苗絕大多數(shù)為具有 鑒別診斷能力的活疫苗，有匈牙利的天然弱毒Bartha-K/61株疫苗產(chǎn)品，及四川農(nóng)大郭萬 柱教授主持研發(fā)的豬偽狂犬病活疫苗（SA215株）和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春教授主持研發(fā)的 的豬偽狂犬病活疫苗（皿98株）。該類疫苗已投放市場使用多年，對(duì)豬偽狂犬病的預(yù)防與控 制發(fā)揮了重要作用。雖然偶爾有病毒分離的報(bào)道，但總體而言該病得到了有效的控制。
[0003] 但2011年W來，許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)模化豬場出現(xiàn)了疑似PR流 行，主要表現(xiàn)為豬群班抗體陽性率顯著升高，母豬產(chǎn)弱仔、死胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡 等。尤其2-3日齡仔豬發(fā)病嚴(yán)重，從發(fā)病至死亡僅5小時(shí)。目前，該病已波及國內(nèi)多個(gè)省市 及地區(qū)，已造成大量仔豬死亡及巨大經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 因此，本發(fā)明從臨床分離流行毒株，經(jīng)基因序列分析及免疫保護(hù)試驗(yàn)，確定為豬偽 狂犬病病毒PRV-YF株，擴(kuò)繁后經(jīng)BEI滅活，制備滅活疫苗，并評(píng)價(jià)其免疫效力。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬偽狂犬病病毒PRV-YF 株。
[0006] 本發(fā)明目的之二在于提供所述豬偽狂犬病病毒PRV-YF株在制備豬偽狂犬病毒滅 活疫苗中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明目的之S在于提供含有所述豬偽狂犬病病毒PRV-YF株的豬偽狂犬病病毒 滅活疫苗。
[000引本發(fā)明目的之四在于提供所述豬偽狂犬病毒滅活疫苗的制備方法，通過優(yōu)化各工 藝參數(shù)W提高滅活疫苗的免疫保護(hù)效力或安全性。
[0009]為解決上述問題，本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明從發(fā)病仔豬的腦、扁桃體等組織中分離并經(jīng)過傳代適應(yīng)得到豬偽狂犬病病 毒PRV-YF株；本發(fā)明將豬偽狂犬病病毒PRV-YF株提交至專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)保藏，其保藏名稱 為：偽狂犬病病毒野生毒株P(guān)RV-YFPseudor油iesvirusstrainPRV-YF，保藏單位；中國 典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏日期；2015年01月21號(hào)，保藏號(hào)為CCTCCN0:V201502,保藏地 址是；中國武漢武漢大學(xué)。
[0011] 將本發(fā)明分離的豬偽狂犬病病毒PRV-YF株進(jìn)行TK、班、gG基因的序列分析及抗 原變異性分析，其中，扁桃體與腦組織樣品均分別擴(kuò)增出754bp的TK基因片段與578bp的 班基因片段，表明扁桃體與腦組織均為PRV陽性；將PRV-YF株接種8~10周齡Ba化/C小 鼠，表現(xiàn)注射部位痊癢、毛發(fā)趟亂，精神沉郁；小鼠幾乎全部死亡，注射部位痊癢、毛發(fā)趟亂， 精神沉郁等癥狀表現(xiàn)更加明顯，注射部位被抓至潰爛，8化后陸續(xù)有小鼠死亡，癥狀表現(xiàn)明 顯。因此，確定PRV-YF株為豬偽狂犬病病毒臨床變異株，現(xiàn)有豬偽狂犬病活疫苗不能使免 疫動(dòng)物對(duì)該毒株獲得完全保護(hù)。
[0012] 所述的豬偽狂犬病病毒PRV-YF株在制備豬偽狂犬病毒滅活疫苗中的應(yīng)用。
[0013] 一種豬偽狂犬病病毒滅活疫苗，其包括佐劑和含有滅活后的權(quán)利要求1所述的豬 偽狂犬病病毒PRV-YF株的病毒液。
[0014] 上述的豬偽狂犬病病毒滅活疫苗的制備方法，其包括W下步驟：
[0015] 1)培養(yǎng)如上述的豬偽狂犬病病毒PRV-YF株，獲得病毒液；
[0016] 2)在病毒液中加入滅活劑將病毒滅活，然后加入終止劑終止滅活，獲得PRV-YF株 滅活病毒液；
[0017] 3)制備水相和油相，乳化，即得豬偽狂犬滅活疫苗。
[0018] 具體地，作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，在步驟1)中所制得的病毒液的病毒含量不 低于l〇7'°TCID5yml。
[0019] 具體地，作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，步驟2)中所述的滅活劑為二己締亞胺；按 w/v計(jì)，向病毒液中加入的二己締亞胺占病毒液總量的0.1%~1%。
[0020] 具體地，作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，滅活時(shí)間為12~60h;滅活溫度為37°C。
[0021] 具體地，作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，步驟2)中所述的終止劑為硫代硫酸鋼；按 w/v計(jì)，向病毒液中加入的硫代硫酸鋼占病毒液總量的0. 1 %~5%。
[0022] 具體地，作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，按w/v計(jì)，向病毒液中加入的硫代硫酸鋼 占病毒液總量的0. 5%~5%。
[0023] 具體地，作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，步驟3)包括W下步驟：
[0024] A.水相制備；取步驟2)制得的PRV-YF株滅活病毒液加入終濃度為0. 75%的吐 溫-80,邊加邊攬拌，直到吐溫-80徹底溶解，制得水相；
[0025] B.油相制備：取白油141.75份，加入7.5份司本80,充分混勻，121°C下滅菌 30min，冷卻至室溫備用，制得油相；
[0026] C.將上述的油相和水相按1. 5 : 1的比例乳化；將水相緩慢加入油化均質(zhì)1~ 3min后剪切，制成均勻乳劑，即為豬偽狂犬病滅活疫苗。
[0027] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[002引本發(fā)明從發(fā)病仔豬的腦、扁桃體等組織中分離并鑒定得到的豬偽狂犬病病毒PRV-YF株具有良好的