Her3結合多肽的制作方法
【專利說明】HER3結合多肽 發明領域
[0001] 本公開內容涉及與人類表皮生長因子受體3(本文中被稱為HER3)結合的多肽，并 且涉及此類多肽在成像和治療中的用途。
[0002] 背景
[0003]包括EGFR(ErbBl或HER1)、ErbB2 (HER2)、ErbB3 (ERBB3 或HER3)和ErbB4 (HER4) 的跨膜酪氨酸激酶受體中的表皮生長因子受體家族通過細胞內信號通路的復雜網絡參與 調節關鍵細胞功能（例如細胞增殖、存活、分化和迀移）。由于J1ER3的無活性的酪氨酸激酶 結構域，J1ER3與該家族的其它受體不同，并因此通過配體引起的與其它酪氨酸激酶受體一 起形成的異源二聚體來傳遞信號（Guy等人，ProcNatlAcadSci91:8132-8136(1994); Sierke等人，BiochemJ322(Pt3):757-763(1997))。結果，該受體在腫瘤進展中的意義 長期以來是個謎。但是，最近，ffiR3作為其家族成員的變構的激酶激活劑已被感興趣。特 別地由HER2和HER3形成的異二聚體被稱為是下游細胞內信號轉導的異常強烈的激活劑 (Jura等人，ProcNatlAcadSci106:21508-21613(2009);Citri等人，ExpCellRes 284:54-65(2003))。這種HER2-HER3信號轉導對甚至被認為是在HER2驅動的乳腺癌中的 致瘤單位（HolbroT等人，ProNatlAcadSci100:8933-8938(2003))。另外，HER3 受體 的上調已顯示在體外和體內在過表達HER2的乳腺癌中對酪氨酸激酶抑制劑的抵抗發揮重 要作用（Sergina等人，Nature445:437-441(2007) ;Kong等人，PLoSOne3:e2881 (2008); Garrett等人，ProcNatlAcadSci108:5021-5026(2011))。
[0004] 但是，在人類癌癥中HER3的重要性并不局限于HER2驅動的乳腺癌。還顯示HER3 是HER3過表達的前列腺癌異種移植物的體內致腫瘤性所需要的、通過自分泌信號轉導回 路來維持卵巢癌的亞類的體內增殖，并且參與ER+乳腺癌細胞系的內分泌耐受，僅舉幾 個例子（Soler等人，IntJCancerl25:2565-2575(2009);ShengQ等人，CancerCell 17:412-412 (2010);Liu等人，IntJCancer120:1874-1882 (2007);Frogne等人&'east CancerResTreat114:263-275(2009))。總而言之，這些發現證明HER3信號通路作為在 人類癌癥中的重要的治療靶點的潛力。另外，HER3表達具有預后價值，因為高水平的受體表 達與過表達HER2的患者相比，與顯著地較短的存活時間有關（Tanner等人，JClinOncol 24 (26): 4317-23 (2006)，Reschke等人，ClinCancerRes14 (16): 5188-97 (2008))。
[0005]最近被批準的針對EGFR和HER2受體的療法的相對大的比例基于單克隆抗體。與ErbB家族的被很好地研宄的EGFR和HER2受體成員形成對比，抗HER3抗體的用途有相對較 少的報道。Ullrich和合作者已報道抗HER3單克隆抗體在乳腺癌的細胞模型中抑制HER3 介導的信號轉導（vanderHorst等人，IntJCancer115(4):519_27(2005))。但是，盡管 已報道了幾種利用全長單克隆抗體的成功的癌癥治療研宄，但是這類劑對于靶向實體腫瘤 (不是對于診斷也不是對于治療劑裝載目的）并不總是最佳的。治療效果取決于藥物遍及 腫瘤的有效分布，并且分子成像取決于在腫瘤吸收和周圍正常組織之間的高的比例。由于 腫瘤滲透率（包括溢出）與分子的大小負相關，相對較大的抗體分子（例如IgG)固有地具 有差的組織分布和滲透能力。而且，對于分子成像，抗體的異常地長的體內半衰期導致相對 較高的血液信號以及從而相對較差的腫瘤-血液反差。
[0006] 最近，利用組合蛋白工程生成了源自來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白A的結構域B的，基于Z結構域的3-螺旋束支架的小的多的HER3特異的分 子（Kronqvist等人，ProteinEngDesSel24:385-396(2010) ;W02011/056124)。這些對 HER3具有亞納摩爾級親和力的Z變體被證實在體外通過阻斷配體引起的HER3信號轉導具 有對乳腺癌細胞系的抗增殖效應（G6strillg等人，PLoSOne7:e40023(2012))。這些生長 抑制效應被進一步證實是在Z變體分子和配體調蛋白（heregulin)之間的競爭性HER3結 合的結果。
[0007] 但是，由于該受體在腫瘤細胞中的相對低的表達，HER3受體的體內靶向可能是 有挑戰的。已報道了每細胞1〇3至10 4個受體的典型表達水平（Aguilar等人，Oncogene 18:6050-6062(1999);Robinson等人，BrJCancer99:1415-1425 (2008))。除了高的腫瘤 吸收之外，在腫瘤中延長的保留時間對藥物的有效的治療效果是十分重要的。由于高的血 管通透性并快速地擴散至腫瘤，小的靶向劑諸如源自Z結構域的多肽具有在腫瘤中以高水 平積累的能力（Schmidt和Wittrup,MolCancerTher8:2861-2871(2009))。但是，低分 子量的未結合蛋白將會被快速地從腫瘤清除并且然后通過腎從循環清除。結果，小尺寸靶 向劑對癌細胞的高親和力對于增加的腫瘤保留是十分重要的。而且，對于具有低表達（每 細胞1〇 4革巴蛋白或更少）的受體蛋白的有效靶向，最近的結果暗示小的多肽（例如源自Z 結構域的多肽）的親和力應該盡可能地高，優選地具有以低皮摩爾級計或更小的結合常數 KD(Tolmachev等人（2012)，JNuclMed53(6):953-60)。
[0008] 因為HER3可與EGF家族的其它成員在相同的腫瘤細胞上被表達，靶向HER3和EGF 家族的另一個成員的雙特異分子的制備最近已引起一些興趣。此類雙特異性分子可例如被 用作靶向載體用于在分子成像應用中增加靶向的特異性以及同時地靶向HER3和在腫瘤上 表達的另一種抗原。
[0009] 發明描述
[0010] 本公開內容的目的是提供一組新穎的HER3結合劑，其以高親和力結合HER3。
[0011] 本公開內容的另一個目的是提供一組新穎的HER3結合劑，其例如可被用于靶向 HER3表達細胞、此類HER3表達細胞的分子成像和/或HER3相關狀況的治療。
[0012] 本公開內容的另一個目的是提供一組經限定的HER3結合劑，該組與以前在 W02011/056124中限定的HER3結合多肽的組不同。
[0013] 因此，根據本發明的一方面，提供了HER3結合多肽，包含HER3結合基序（BM)，該基 序由選自以下的氨基酸序列組成：
[0014] i)EKYX4AYX7EIffXnLPNLTX17X18QX20AAFIGX26LX28D
[0015] 其中，彼此獨立地，
[0016] 父4選自六、￡、1、]\1、隊〇、1?、3和1';
[0017] X7選自F和Y;
[0018] Xn選自 E和Q;
[0019] X17選自 K、N、R和 V;
[0020] X18選自 F、M、N、R、T、Y和W;
[0021] X2Q選自 A和K;
[0022] X26選自K和S;
[0023] X28選自E和Q;以及
[0024] ii)與在i)中限定的序列具有至少96%同一性的氨基酸序列。
[0025] 以上關于HER3結合多肽的序列的類的限定是基于幾種新穎的多肽變體的序列的 分析，所述幾種新穎的多肽變體選自基于以前顯示展示J1ER3結合并在W02011/056124中公 開的序列而設計的文庫。這些多肽轉而是源自葡萄球菌蛋白A的結構域之一的母本支架的 隨機變體。
[0026] 鑒定的HER3結合基序或"BM"對應于母本支架的靶結合區域，該區域構成在三螺 旋束蛋白結構域內的兩個a螺旋。在母本支架中，兩個BM螺旋的變化的氨基酸殘基組成 用于與抗體的恒定的Fc部分相互作用的結合表面。通過結合表面殘基的隨機變異和隨后 的變體的選擇，結合表面的Fc相互作用能力最初地被與HER3相互作用的能力代替，如在 W02011/156124中所描述的。在導致本公開內容的研宄中，生成了新的序列，其出乎意料地 顯示出例如與適合用于分子成像的親和力參數相關的優越的性能。
[0027] 如技術人員將認識到的，諸如如本文限定的多肽的HER3結合能力的任何多肽的 功能取決于多肽的三級結構。因此對多肽的氨基酸序列進行較小的改變而不大程度地影響 其三級結構和功能是可能的。
[0028] 因此，在一個實施方案中，多肽包括序列i)的BM的修飾的變體，其使得產生的序 列與屬于由序列i)限定的類的序列至少96%相同。在一些實施方案中，此類改變可在如本 文公開的HER3結合多肽的序列的所有位置進行。在其它實施方案中，此類改變可僅在也被 稱為支架氨基酸殘基處的非可變位置進行。在此類情況中，在可變位置即以"X"（例如以上 限定的BM的X4、X7、Xn、X17、X18、X2(l、\6和X28)表示的位置改變是不被允許的。例如，屬于 多個氨基酸殘基的某一功能分組（例如疏水性、親水性、極性等）中的氨基酸殘基可被取代 為來自相同功能組的另一個氨基酸殘基是可能的。
[0029] 可如以下計算如遍及說明書所使用的術語"％同一性"。利用CLUSTALW算法 (Thompson等人，NucleicAcidsResearch，22:4673_4680(1994))將查詢序列與革E序列比 對。在窗口中進行對應于最短的對齊序列的比較。在一些實例中最短的對齊序列可以是靶 序列。在其它實例中，查詢序列可構成最短的對齊序列。在每一個位置的氨基酸殘基均被 比較，并且在查詢序列中具有靶序列中相同的對應的位置的百分比被報告為％同一性。
[0030] 在一個實施方案中，發明提供了如以上限定的HER3結合多肽，其中，在序列i)中， 彼此獨立地，
[0031] 父4選自六、已、]\1、隊〇、3和1';
[0032] X7選自F和Y;
[0033] Xn為Q;
[0034] X17選自K 和 R;
[0035] X18選自M、Y 和W;
[0036] X2(l為K;
[0037] 父26為K;
[0038] 父28為Q。
[0039] 在一個實施方案中，在序列1)中的乂4選自4、￡、11、隊〇、3和1'。在更特定的實施 方案中，在序列i)中的X4選自N和Q。在更加特定的實施方案中，在序列i)中的X4SN。 在另一個實施方案中，在序列i)中的\為〇。
[0040] 在一個實施方案中，在序列i)中的XnSQ。
[0041] 在一個實施方案中，在序列i)中的X17選自K、N和R。在另一個實施方案中，在序 列i)中的X17選自K和R。在更特定的實施方案中，在序列i)中的X17SK。在另一個實施 方案中，在序列i)中的X17SR。
[0042] 在一個實施方案中，在序列i)中的X18選自M、Y和W。在更特定的實施方案中，在 序列i)中的X18選自Y和W。在更加特定的實施方案中，在序列i)中的X18SY。在另一個 實施方案中，在序列i)中的X18SW。在另一個實施方案中，在序列i)中的x18Sm。
[0043] 在一個實施方案中，在序列i)中的X17X18選自KW、KY、KM和RY。
[0044] 在一個實施方案中，在序列i)中的X2(l為K。
[0045] 在一個實施方案中，在序列i)中的&6為1(。
[0046] 在一個實施方案中，在序列i)中的\8為〇。
[0047] 在一個實施方案中，序列i)符合以下四個條件I、II、III和IV中的至少兩個：
[0048] I)XnSQ;
[0049] II)X17X18選自KW、KY、KM和RY;
[0050] III)X2Q為K;
[0051] iv)x28Sq。
[0052] 在更特定的實施方案中，序列i)符合條件I、II、III和IV中的至少三個，諸如所 有四個。
[0053] 如在隨后的實驗部分詳細描述的，HER3結合變體的選