一種制備魚鱗膠原蛋白活性肽的方法
【專利說明】
[0001]技術領域:
本發明涉及漁業加工副產品的開發利用領域，具體涉及一種采用超聲預處理及酶膜耦合反應技術制備魚鱗膠原蛋白活性肽的一種技術。
[0002]技術背景:
膠原蛋白是構成動物機體的重要功能物質，它具有其他合成高分子材料無法比擬的生物相容性和生物可降解性。目前膠原蛋白已廣泛地應用于食品、化妝品、營養保健品、生物肥料以及醫用材料等領域。由于魚鱗中含有豐富的膠原蛋白，以及近年來各種動物流行疾病的發生，使得人們對來源于牲畜的膠原蛋白的安全性發生了質疑。因此研宄和開發魚鱗等水產品廢棄物中的膠原蛋白逐漸受到人們重視。魚鱗膠原蛋白是一種天然的、無毒害的、食源性好的蛋白質，因此近年來出現了許多有關利用魚鱗膠原蛋白來制備具有抗氧化、降血壓活性多肽的報道。
[0003]制備膠原蛋白多肽主要的方法有酸性水解法、堿性水解法、酶水解法和發酵法。但是用酸性水解或者堿性水解得到小肽或多肽不易被人體吸收，所以現在膠原蛋白肽主要通過酶解法和微生物發酵法來制備。現在利用酶解法制備膠原蛋白肽已有大量的文獻報道，但是普遍存在酶解時間長、酶解效率低、產量低、成本高等缺點，不適合工業化生產。其原因主要是在酶解過程中所產生的產物抑制效應，底物過度水解，導致酶解效率低，酶解產量低。另一方面，酶資源的浪費，產物分離成本的增加，導致生產成本增高。據報道，在蛋白底物酶解之前進行超聲預處理可以提高酶解效果，縮短酶解時間，并且增大酶解產物的生物活性。另外有關報道證實，采用酶膜分離的方式可以有效的解決上述在酶解過程中存在的冋題。
[0004]酶膜耦合技術利用膜分離在酶解的同時對酶解產物進行分離，目標多肽被分離出來，酶、大分子多肽和蛋白等未反應物返回到反應體系繼續反應。這種邊反應邊分離的技術方案其優勢在于:(I)通過產物的在線分離，減少產物抑制效應，加快反應速度；(2)通過產物的在線分離，減少產物的過度降解，提高產品活性；(3)通過酶的循環使用，提高酶的利用率。近年來，國內外已有學者應用酶膜耦合技術制備生物活性肽并取得了較好的效果。現研宄的酶膜耦合方式主要有間歇式不補料耦合、連續式只補水耦合、等濃度連續補料耦合、梯度稀釋補料耦合等方式。根據文獻報道中酶解-膜分離耦合技術的研宄，從間歇式的酶解-膜分離到連續性的酶解-膜分離，但連續式的酶膜耦合研宄均為只補水連續反應，或者等濃度補料的連續反應，只補水反應會在生產過程中帶來大量的水分，給后期產物分離制備帶來很大的麻煩，并且只補水反應會使酶利用率低下。等濃度補料的連續反應，酶利用率較只補水要高，但是會存在膜污染嚴重，酶膜耦合反應時間短，蛋白轉化率低等缺點。
[0005]
【發明內容】
:
為克服已有方法的不足，本發明的目的是提供一種產物抑制效應低，酶的利用酶的利用度高，生產成本低的制備魚鱗膠原蛋白活性肽的技術。聚能式逆流脈沖超聲波輔助酶解魚鱗膠原蛋白，強化酶解反應。利用稀釋梯度補料酶膜耦合反應技術制備魚鱗膠原蛋白肽，減少了產物抑制效應，進一步改善了酶解反應效果，提高了酶的利用度，降低了生產成本。
[0006]為實現以上目的，本發明是通過以下技術手段實現的:先對魚鱗膠原蛋白超聲波預處理，再進行酶膜偶聯技術制備魚鱗膠原蛋白肽，具體技術方案是:
(I)超聲的預處理:配制底物濃度為20 g/L的魚鱗膠原蛋白溶液1000 mL，經聚能式逆流脈沖超聲波預處理12 min，超聲頻率28 kHz、超聲功率150 W、脈沖時間8 S、間歇時間
5 S0
[0007](2)酶膜耦合制備魚鱗膠原蛋白肽:將超聲預處理后的魚鱗膠原蛋白溶液pH調到8.7，并且預熱到50°C，取400 mL加入反應器內。加入堿性蛋白酶酶解(酶解溫度50 °C，pH8.7，加酶量0.14 AU/g)，在反應器內酶解25 min后啟動超濾循環裝置，膜的截流分子量為1~3 kDa，不斷補加已配好濃度的底物溶液到反應器中以維持反應液體積恒定，實驗以每隔5 min補料一次，每隔25 min降低0.2%濃度梯度。維持循環轉速為220 rpm，進口初始壓力為1.1 bar，調節回流閥使出口初始壓力為0.3 bar，收集透過液，即可得到魚鱗膠原蛋白肽的提取液。
[0008]本發明所具有的優點是:
本發明利用聚能式逆流脈沖超聲波輔助酶解魚鱗膠原蛋白，提高其酶解產物的ACE抑制率。再利用稀釋梯度補料酶膜耦合反應技術，強化酶解反應，進行蛋白酶水解制備魚鱗膠原蛋白肽，單位酶產肽量為達到9.25 g肽/ (AU酶)，單位酶產肽量為不補料效率的2.71倍，改善了酶解效果，與其他酶膜耦合方式相比，單位酶產肽量大大提高，有效的減少了產物抑制效應，提高了酶的利用度，降低了生產成本。下面結合【附圖說明】及具體實施例進行詳細闡述。
[0009]【附圖說明】:
圖1為本發明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補料酶膜耦合反應技術制備魚鱗膠原蛋白ACE抑制肽的多頻逆流超聲波提取設備圖。
[0010]圖2為本發明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補料酶膜耦合反應技術制備魚鱗膠原蛋白ACE抑制狀的超濾裝置不意圖。
[0011]【具體實施方式】:
圖1為本發明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補料酶膜耦合反應技術制備魚鱗膠原蛋白ACE抑制肽的多頻逆流超聲波提取設備圖。將經過雜蛋白和鈣脫除處理的魚鱗溶液加入燒杯I中，水浴加熱到設定的溫度，開啟循環泵2轉速(180 mL/min) 一定，將溶液輸送到超聲處理室4中，保持超聲池內液面體積不變。開啟超聲發生器，進行逆流超聲處理。聚能式逆流超聲提取設備的頻率為28 kHz，超聲探頭3功率為150 W?
[0012]圖2為本發明使用的超聲輔助酶解-稀釋梯度補料酶膜耦合反應技術制備魚鱗膠原蛋白ACE抑制肽的超濾裝置示意圖。I和5為恒溫水浴池，根據工作需要調節介質溫度，從而預熱補料罐2和酶解罐4中的液料，酶解反應在酶解罐4中進行。反應25 min后啟動超濾循環裝置，通過進料泵6將酶解罐4中的液料輸進膜分離裝置10中，并通過壓力表7調節進口初始壓力為L I bar。打開調節回流閥9，維持壓力表8的出口初始壓力為0.3 bar，使一部分回流液回流到酶解罐4中。透過液通過透過液閥11從端口 12處流出并收集。反應過程中循環轉速，溫度、PH保持恒定，并且打開補料泵3不斷將