一種類芽孢桿菌細菌素提取物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種類芽孢桿菌細菌素提取物及其制備方法 和應用。
【背景技術】
[0002] 細菌素是某些細菌產生的具有抗菌活性的物質，主要成分為多肽、蛋白質或蛋白 質復合物，最早由Jacob于1953年提出。近年來，廣譜抗生素的普及甚至濫用所帶來的負面 效應日益突出，新型抗生素替代品的研宄迫在眉睫。作為蛋白質類物質的細菌素，由于可被 蛋白酶降解，其安全性很高，故受到越來越多的關注。盡管目前開發獲得的細菌素（Nisin) 已具備了極高的防腐與抑菌的應用價值，但受Nisin本身的特性（低pH條件下性質穩定， pH>7. 0抑菌活性逐漸喪失）的影響，其應用的范圍受到了極大的局限性，其次，目前細菌素 的獲得都來自化學合成培養基，此類培養基成分多樣，配方復雜，配制過程繁瑣具有潛在食 品安全風險，再者，制備細菌素的成本非常高、細菌素的來源相對有限，上述問題很大程度 上限制了細菌素的開發和利用。
[0003] 中國專利申請（CN 103740618A)公開了類芽孢桿菌屬的一個新菌種， Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并將其中的模式菌株 BD3526 于 2013 年 10 月 14 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，該菌株的保藏編號為： CGMCC No. 8333,該菌株的菌落非常粘稠，表明該菌株具有高產胞外多糖的生理特性，但尚 未得到該菌株產出的抑菌性細菌素。
【發明內容】
[0004] 因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有細菌素穩定性差，制備成本高，來源 不足的現狀，提供了一種類芽孢桿菌細菌素提取物及其制備方法和應用。
[0005] 本發明人發現，類芽孢桿菌（Paenibacillus sp. )CGMCC No. 8333菌株發酵番茄汁 培養基獲得的發酵液上清經超濾截取的低分子量部分，經冷凍干燥后可獲得具有強烈抑菌 性的類芽孢桿菌細菌素提取物，通過反復驗證，該細菌素提取物的抑菌效果穩定，從而完成 了本發明。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一為：一種類芽孢桿菌細菌素提 取物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0007] (1)將類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)接種于番茄汁培養基中震蕩培養獲得發 酵液；
[0008] (2)將步驟（1)所得發酵液離心取上清，超濾取低分子部分，冷凍干燥即得。
[0009] 其中步驟（1)為將類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)接種于番前汁培養基中震蕩 培養獲得發酵液。其中所述類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)為本領域常規的類芽孢桿 菌，較佳地為類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)，其保藏編號為CGMCC No. 8333。所述類芽 孢桿菌為現有技術，其制備方法為本領域常規制備方法，或者通過從保藏中心購買獲得。其 中所述番茄汁培養基為本領域常規的番茄汁培養基，所述的番茄汁培養基較佳地由包括由 以下步驟組成的方法制備而得：清洗成熟番茄，去皮，榨汁，過濾后煮沸，4, 000-12, OOOg離 心5~lOmin，取上清，滅菌，冷卻即得。其中所述的過濾采用的方法為本領域常規的過濾 方法，較佳地為采用100目紗布過濾，煮沸的時間較佳地為1~10分鐘，所述番茄汁培養基 的pH值較佳地為pH6. 0~8. 0,所述的滅菌溫度較佳地為110~135°C，滅菌時間較佳地為 10~30分鐘。其中所述類芽孢桿菌的接種量較佳地為1~5%，更佳地為2~3%，最優選 2. 5%，所述百分比為體積百分比，類芽孢桿菌的發酵培養的溫度較佳地為25°C~37°C，更 佳地為30°C~35°C，最優選為32°C，所述震蕩的速度較佳地為lOOrpm~300rpm，更佳地為 150rpm~250rpm，最優選地為200rpm，所述發酵培養的時間較佳地為24小時~72小時，更 佳地為36小時~48小時，最優選地為42小時。當所述發酵培養的溫度和時間，或者類芽 孢桿菌的接種量不在上述范圍值之內時，所得發酵產物的抑菌效果會產生顯著降低。
[0010] 發明所述制備方法中，將所述類芽孢桿菌CGMCC No. 8333接種于番茄汁培養基之 前，較佳地還包括該類芽孢桿菌CGMCC No. 8333活化獲得類芽孢桿菌種子的步驟。所述活 化的步驟較佳地為：將本發明所述類芽孢桿菌CGMCC No. 8333接種在TYC固體培養基中， 25~30°C培養18~28小時即得類芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子；將所得類芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子的菌落均勻分散于TYC液體培養基內，再按2%~5%體積百分比的接種量接 種于TYC液體培養基中震蕩培養，搖床轉速為100~200rpm，培養18-28小時，將所得培養 物離心棄去上清，所得菌體用無菌蒸餾水洗滌后，用原培養體積的無菌蒸餾水懸浮，即得發 酵用的類芽孢桿菌的種子。
[0011] 其中所述步驟⑵為將步驟（1)所得發酵液離心取上清，超濾取低分子部分，冷凍 干燥即得。
[0012] 其中所述離心的速度較佳地為8, 000~12, 000g，更佳地為10000~11000g，離心 的時間較佳地為5~10分鐘，更佳地為6~8分鐘。當所述離心的速度和離心的時間不在 上述范圍值之內時，所得發酵產物的抑菌效果會產生顯著降低，其抑菌性能的穩定性也會 大幅下降。
[0013] 其中所述的超濾為本領域常規的超濾方法，所述超濾是指以大分子與小分子分離 為目的，以壓力為推動力的膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定 孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部 分的純化。
[0014] 所述超濾中使用的超濾膜為本領域常規的超濾膜，所述超濾膜的截留分子量較佳 地為3, 000~8, 000Da，更佳地為5, 000Da。
[0015] 其中所述的冷凍干燥為本領域常規的冷凍干燥方法，所述冷凍干燥方法較佳地 為真空冷凍干燥，所述真空冷凍干燥條件較佳地為：板層極限溫度< -60°C，冷阱極限溫 度_70°C，板層裝料厚度0. 5~2. 0mm，真空度10~30Pa。
[0016] 為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二為：一種如本發明所述的制備 方法所得類芽孢桿菌細菌素提取物。
[0017] 本發明所述類芽孢桿菌細菌素提取物的制備方法中各步驟所述技術特征的優選 范圍與上文所述類芽孢桿菌細菌素提取物的制備方法中相應的內容完全一致，具體請參見 上文所述內容，此處不再贅述。
[0018] 為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三為：如本發明所述的類芽孢桿 菌細菌素提取物在制備食品防腐劑中的應用。
[0019] 本發明所述類芽孢桿菌細菌素提取物可以廣泛應用于制備各種食品防腐劑，功能 性食品或者功能性飼料中。所述應用較佳地為在制備食品防腐劑中的應用。
[0020] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0021] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0022] 本發明的積極進步效果在于：
[0023] 1、目前細菌素提取物的制備都依賴于化學合成培養基，而運用番茄汁制備細菌素 提取物的研宄尚未報道過，本發明首次將番茄汁培養基作為一種天然的發酵培養基應用于 細菌素提取物的制備，因而其廣物具有更尚的食品安全性。
[0024] 2、本發明所述用于制備類芽孢桿菌細菌素提取物的原料為番茄，其來源廣、成本 低，發酵菌種為類芽孢桿菌單一菌種，上述組合有利于產品品質的標準化與工業大規模生 產的成本控制。
[0025] 3、解決了當前細菌素來源狹隘的現狀，開創性地將類芽孢桿菌應用于細菌素的制 備工藝。
[0026] 4、本發明所述的類芽孢桿菌細菌素提取物的制備方法工藝簡單，僅需四步：發酵、 離心、超濾、凍干即可完成，大大減少了傳統復雜工藝可能帶來的污染問題，其次，整個制備 過