一種三磷酸腺苷(atp)的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用腺苷(AR)為原料生產三磷酸腺苷(ATP)的方法，具體涉及三磷酸腺苷發酵合成二步發酵:第一步為發酵提轉化酶，第二步為在轉化酶的催化作用下將腺苷磷酸化為三磷酸腺苷。
【背景技術】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)是一種由一個腺嘌呤，一個核糖和一個三磷酸單位組成的核苷酸藥物，分子式CltlH16N5O13P3，分子量為507。它是生物體內的能量轉換器和貯存器，在人體能量代謝中起著重要的作用。ATP也是生物體內重要的代謝物質，作為代謝的中間體、輔酶參與生物體內脂肪、蛋白質、糖類和核酸等的代謝。在臨床應用上，ATP除了能作為搶救危重病人的輔助藥品外，還對急慢性肝炎、腎炎、心肌炎、冠狀動脈硬化、進行性肌肉萎縮、再生障礙性貧血、風濕性關節炎等病癥具有良好的治療作用。三磷酸腺苷二鈉原料以及注射液已收載于《中國藥典》2010年版二部。
[0003]三磷酸腺苷的合成主要有化學合成法、酶催化合成、光合磷酸化和氧化磷酸化、微生物酶系催化合成等方法。考慮到藥品的安全性、環保、生產成本等因素，用腺苷為原料微生物酶系催化合成三磷酸腺苷成為目前工業生產三磷酸腺苷的主要工藝。然而，我國三磷酸腺苷生產水平總體還比較低，產品的產量、回收率、產品的純度等方面達不到進口產品的水平。
申請號為95100148.5的中國專利申請文件中公開了一種“用腺苷(AR)為原料生產腺苷三磷酸(ATP)的新工藝”。該工藝主要包括:啤酒酵母冷凍處理、發酵提酶、離心分離、腺苷發酵合成ATP、酒精沉淀、沉淀物回溶、冷凍除鹽、稀釋后離子交換、樹脂洗滌洗脫、樹脂脫色、活性炭除熱源、結晶、干燥等。該工藝由于酵母與轉化酶的分離不徹底，發酵后期酵母所產酶系成分變化，轉化酶活力下降，使得三磷酸腺苷轉化率為90%，而且發酵過程中因菌體衰老自溶等因素帶入較多雜物等問題；其次在發酵合成液中除了有三磷酸腺苷外，還有未反應的AR及副反應產物AMP、ADP，及微生物所需的營養物質磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等無機鹽。發酵合成液中無機鹽的濃度約4萬mg/L。在離子交換吸附過程中，離子與ATP競爭吸附到離子交換樹脂上，造成樹脂吸附ATP量僅約5?13克/100克樹脂(201 X 7)，采用酒精沉淀脫鹽工藝后樹脂吸附ATP量提高到18?22克/100克樹脂(201 X 7)，但需要消耗ATP發酵液體積4?5倍的無水乙醇。三磷酸腺苷回收率和設備利用率低，產品中雜質較多。
[0004]綜合以上【背景技術】，如何通過高效分離技術提高酶液的純度和降低合成液中無機鹽的含量，從而提高三磷酸腺苷的產量、回收率、純度成為亟待解決的技術問題。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，提供一種能提高ATP產品的生產能力、回收率、產品純度，降低化學試劑的消耗，簡化生產工藝，減少污染排放，明顯提高經濟效益的三磷酸腺苷的生產方法。
[0006]本發明的目的是通過如下技術方案來完成的，一種三磷酸腺苷(ATP)的生產方法，它主要是利用酵母細胞內的酶系統，以葡萄糖為能源經糖酵解途徑使腺苷(AR)磷酸化合成三磷酸腺苷，所述的生產方法包括如下步驟:
a)發酵反應鍋中加去離子水，將水的溫度升到30?42°C，定量投加啤酒酵母，再定量投加葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀溶液，調節PH值在6.0?7.0范圍內，保持溫度為30?42°C并發酵2.0?2.5小時提轉化酶，得到發酵提酶液；上述各反應物的用量為:啤酒酵母泥250?280g/L，葡萄糖35?45 g/L，磷酸氫二鉀25?30 g/L，磷酸二氫鉀 20 ?25 g/L ο
[0007]b)發酵提酶液需經過板框過濾去除酶液中顆粒度較大的酵母泥雜質，得到粗濾提酶液；
c)經過板框過濾的粗濾提酶液再經過精度為0.1?10 μm的微濾膜處理，進一步去除細微的酵母等雜質，得到清酶液；
d)在清酶液中加入反應物腺苷20?40g/L，再加入營養物質硫酸鎂1.6?2.0g/L，調節PH值在6.0?7.0范圍內，并在溫度為32?35°C條件下發酵4.0?6.0小時，腺苷由葡萄糖提供能量，在轉化酶的催化作用下，腺苷磷酸化為三磷酸腺苷，三磷酸腺的濃度為36?72g/L ;立即加冰水冷卻，將溫度降低到15?20°C ；
e)采用截留分子量為150?500的納濾膜，通過納濾膜的選擇透過性能使單價的離子透過膜，三磷酸腺苷溶液中80%以上的無機鹽被去除，三磷酸腺苷因分子較大被納濾膜截留在濃縮液中，得到三磷酸腺苷濃縮液；
f)經過去除無機鹽的三磷酸腺苷合濃縮液用去離子水稀釋，使三磷酸腺苷的濃度調整到 0.5 ?1.5% ；
g)上述稀釋后的三磷酸腺苷溶液通過201X 7陰離子交換樹脂吸附，樹脂粒度0.315?
1.25mm ;吸附結束后用去離子水和0.04?0.06%氯化鈉溶液洗滌，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副產物，再用4.0?6.0%的氯化鈉溶液洗脫，得到三磷酸腺苷洗脫液；
h)三磷酸腺苷洗脫液經過截留分子量為3000?10000的超濾膜處理去除蛋白質和熱源，通過活性炭吸附去除色度物質；
i)上述經過超濾膜處理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脫液經過無水乙醇沉淀、離心分離、淋洗和浸泡提純，得到三磷酸腺苷固體，無水乙醇的用量為三磷酸腺苷超濾膜透過液的
2.5?3.5倍，再經過38?42°C的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。
[0008]本發明優選的是:所述的步驟a)中所加入的啤酒酵母，需先經過-15?-20°C冷凍處理，冷凍處理7?10天；
步驟c)中，微濾膜的形式有平板式、中空纖維式等，膜材料選用PP、N-6、PS、PES,PVDF中的一種，操作壓力小于1.0MPa，溫度5?40°C ；
步驟e)中，選用納濾膜的形式包括平板式、中空纖維式，膜材料有芳香族聚酰胺復合膜、磺化聚醚砜，操作壓力0.8?2.5MPa，溫度5?40°C，濃縮3?10倍；
步驟g)中，納濾脫鹽工藝除鹽后，201 X 7陰樹脂的吸附ATP量由原來的5?13g/100g樹脂，提高到24?28g/100g樹脂，優于乙醇沉淀脫鹽工藝吸附18?22 g/100g樹脂的水平，并且無乙醇的使用；陰離子交換樹脂選用凝膠或大孔強堿性的陰樹脂； 步驟h)中，超濾工藝的超濾膜為卷式膜或中空纖維膜，操作壓力0.2?1.5MPa，溫度5?40°C，濃縮3?12倍，膜材料為PP、PAN、PS、PES、PVDF中的任意一種；活性炭為果殼型粉末活性炭或粒狀活性炭。
[0009]本發明采用微濾處理提高轉化酶的純度，提高了三磷酸腺苷的合成轉化率；在三磷酸腺苷發酵合成液的分離提純過程中采用納濾工藝將合成過程中添加的無機鹽類營養物質去除，增強了離子交換樹脂吸附ATP的容量；采用超濾去除蛋白和熱源，提高產品的純度。
[0010]本發明能使磷酸腺苷轉化率達到95%以上，總回收率由達到80%以上，純度提高到98%以上。
[0011]本發明具有能提高ATP產品的生產能力、回收率、產品純度，降低化學試劑的消耗，簡化生產工藝，減少污染排放，明顯提高經濟效益等特點。
【具體實施方式】
[0012]下面將結合具體實施例對本發明作詳細的介紹:一種三磷酸腺苷(ATP)的生產方法，它主要是利用酵母細胞內的酶系統，以葡萄糖為能源經糖酵解途徑使腺苷(AR)磷酸化合成三磷酸腺苷，所述的生產方法包括如下步驟:
a)發酵反應鍋中加去離子水，將水的溫度升到30?42°C，定量投加啤酒酵母，再定量投加葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀溶液，調節PH值在6.0?7.0范圍內，保持溫度為30?42°C并發酵2.0?2.5小時提轉化酶，得到發酵提酶液；上述各反應物的用量為:啤酒酵母泥250?280g/L，葡萄糖35?45 g/L，磷酸氫二鉀25?30 g/L，磷酸二氫鉀 20 ?25 g/L ο
[0013]b)發酵提酶液需經過板框過濾去除酶液中顆粒度較大的酵母泥雜質，得到粗濾提酶液；
c)經過板框過濾的粗濾提酶液再經過精度為0.1?10 μm的微濾膜處理，進一步去除細微的酵母等雜質，得到清酶液；
d)在清酶液中加入反應物腺苷20?40g/L，再加入營養物質硫酸鎂1.6?2.0g/L，調節PH值在6.0?7.0范圍內，并在溫度為32?35°C條件下發酵4.0?6.0小時，腺苷由葡萄糖提供能量，在轉化酶的催化作用下，腺苷磷酸化為三磷酸腺苷，三磷酸腺的濃度為36?72g/L ;立即加冰水冷卻，將溫度降低到15?20°C ；
e)采用截留分子量為150?500的納濾膜，通過納濾膜的選擇透過性能使單價的離子透過膜，三磷酸腺苷溶液中80%以上的無機鹽被去除，三磷酸腺苷因分子較大被納濾膜截留在濃縮液中，得到三磷酸腺苷濃縮液；
f)經過去除無機鹽的三磷酸腺苷合濃縮液用去離子水稀釋，使三磷酸腺苷的濃度調整到 0.5 ?1.5% ；
g)上述稀釋后的三磷酸腺苷溶液通過201X 7陰離子交換樹脂吸附，樹脂粒度0.315?
1.25mm ;吸附結束后用去離子水和0.04?0.06%氯化鈉溶液洗滌，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副產物，再用4.0?6.0%的氯化鈉溶液洗脫，得到三磷酸腺苷洗脫液；
h)三磷酸腺苷洗脫液經過截留分子量為5000?10000的超濾膜處理去除蛋白質和熱源，通過活性炭吸附去除色度物質； i)上述經過超濾膜處理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脫液經過無水乙醇沉淀、離心分離、淋洗和浸泡提純，得到三磷酸腺苷固體，無水乙醇的用量為三磷酸腺苷超濾膜透過液的
2.5?3.5倍，再經過38?42°C的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。
[0014]本發明優選的實施例是:所述的步驟a)中所加入的啤酒酵母，需先經過-15?_20°C冷凍處理，冷凍處理7?10天；
步驟c)中，微濾膜的形式有平板式、中空纖維式等，膜材料選用PP、N-6、PS、PES,PVDF中的一種，操作壓力小于1.0MPa，溫度5?40°C ；
步驟e)中，選用納濾膜的形式包括平板式、中空纖維式，膜材料有芳香族聚酰胺復合膜、磺化聚醚砜，操作壓力0.8?2.5MPa，溫度5?40°C，濃縮3?10