諾西肽生物合成控蛋白NosP的特異性結合序列及相關應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物次生代謝產物生物合成途徑調控領域，具體涉及特異性調控蛋 白NosP在硫肽類抗生素諾西肽生物合成基因簇中特異性結合DNA序列的發現和驗證，以及 通過NosP提高諾西肽在活躍鏈霉菌中生物合成效價的實際應用。
【背景技術】
[0002] 諾西肽（Nosiheptide)，又稱多硫霉素，是由活躍鏈霉菌（Streptomyces actuosus ATCC 25421)產生的一種典型硫肽類抗生素，是最早被發現并投入使用的硫肽類抗生素之 一。諾西肽對革蘭氏陽性菌具有廣譜而強效的抑制作用，尤其是一些耐藥菌如金黃色葡萄 球菌具有強力的殺傷作用。但由于其產量低、水溶性差、生物利用度低，目前只作為添加劑 被用于動物飼料中[McGinnis C，Poult Sci，1978, 57 (6) : 1641-1645.]。諾西肽屬于e類硫 肽類抗生素，由12個氨基酸及其衍生物組成。它的結構已于1977年被鑒定[Prange T, et al, Nature, 1977, 265(5590) : 189-190.]，主要由2部分構成：骨架部分由5個噻唑環，1個 吡啶環構成；側鏈部分由3-甲基-5-甲氧基-2-吲哚酸構成；骨架部分與側鏈之間通過硫 脂鍵相連。
[0003] 鏈霉菌中抗生素的合成和鏈霉菌的生長過程密切相關，受到多層次的復雜調控， 這些調控途徑的核心參與者常為蛋白質類的調控因子，按照調控因子發揮作用的范圍可 粗略地將其分為2大類：全局性調控因子（global regulator)和途徑特異性調控因子 (pathway-specific regulator)。對抗生素合成的第一層次的調控來源于全局性調控因 子（global regulators)，第二層次的調控來源于途徑特異性調控因子。途徑特異性調控 因子通常位于某種抗生素基因簇中，主要對生物合成基因簇內部基因具有特異性調控作用 的調控因子。途徑特異性調控因子多數屬于SARP (Streptomyces antibiotic regulatory Protein)家族[Wietzorrek A, et al, Mol Microbiol, 1997, 25(6) :1181_1184.]，常充 當信號級聯系統中的最后一級效應蛋白，專一性地激活一個或幾個抗生素基因簇的轉錄 [Martin JF，et al，J Ind Microbiol, 1992, 9 (2): 73-90.]，可對抗生素的生物合成效價產 生較強的影響。
[0004] 2009年，中科院上海有機所的劉文教授課題組成功釣取并測定了活躍鏈霉菌 (Streptomyces actuosus ATCC 25421)中約35kb的諾西肽生物合成基因族序列[Pascard C，et al，J Am Chem Soc，1977, 99(19) : 6418-6423.]，為諾西肽生物合成途徑的研宄創造了 便利的條件。生物信息學分析顯示，nosP基因位于S. actuosus諾西肽生物合成基因簇一 端，推測NosP蛋白屬于SARP家族，參與諾西肽生物合成途徑特異性調控，但其具體結合的 DNA序列以及對諾西肽生物合成效價的影響均屬未知。
[0005] 通常SARP家族途徑特異性調控蛋白可通過與生物合成基因簇中特定的DNA序列 結合，對抗生素合成相關基因的轉錄起到重要的調節作用，進而影響抗生素的最終發酵產 量。因此NosP結合DNA序列的發現和驗證為通過遺傳操作技術手段理性改造諾西肽生物 合成途徑，提高諾西肽生物合成效價提供了理論和物質基礎，對增加工業化生產諾西肽的 經濟性和可行性具有廣泛的實用價值和重要意義。
[0006]
【發明內容】
[0007] 本發明的發明目的是尋找和驗證諾西肽生物合成途徑中途徑特異性調控蛋白 NosP的結合DNA序列，改造諾西肽生物合成基因簇，提高諾西肽的生物合成效價和發酵產 量，在此基礎之上，通過萃取-結晶方法進一步簡化諾西肽生產工藝和降低生產成本。
[0008] 為達到上述發明目的，本發明采用了的技術方案包括以下
【發明內容】
： (1) 構建含截短nosP基因的重組表達質粒，并在蛋白質的N端或C端添加純化標簽組 氨酸標簽、GST、MBP中的任意一種，優選組氨酸標簽； (2) 優化NosP的表達條件：37°C下將工程菌振搖培養至培養液0D600 = 0. 8±0. 1后， 加入0. 001-2mM的誘導劑IPTG，并優選出最佳濃度0. 2mM，在10~37°C下誘導培養8-24h， 優選出最佳表達溫度和時間分別是16°C和16小時。
[0009] (3) NosP的純化制備：采用鎳柱親和層析的方法純化制備純度大于95 %的NosP蛋 白。
[0010] (4)NosP的特異性結合序列：根據非編碼區序列設計合成一系列探針，通過EMSA 和DNase I footprinting assay技術尋找活躍鏈霉菌諾西肽生物合成基因簇中的NosP特 異性結合序列并驗證。
[0011] (5)采用不同方案改造諾西肽生物合成途徑，提高諾西肽生物合成效價。
[0012] 本發明對諾西肽生物合成途徑的調控機制認識具有重要的科學價值和意義，對諾 西肽產生菌株理性改造，提高諾西肽發酵效價，降低生產成本具有重要的實際應用價值。
【附圖說明】
[0013]圖 1 NosP 蛋白純化 SDS-PAGE 圖 圖2 NosP蛋白與非編碼區標記探針NCRL-M的EMSA實驗圖
【具體實施方式】
[0014] 以下進一步提供實施實例，這些實施實例有助于理解本發明，僅用作說明而不限 制本發明的應用范圍。
[0015] 實施例1 以S. actuosus ATCC 25421基因組為模板，通過PCR擴增5'-端缺少207個堿基的截短 nosP基因，并在基因序列上下游分別插入限制性內切酶位點，利用本領域的技術人員熟悉 的酶切-連接方法，構建含有不同篩選標記的重組表達質粒：方案1 :借助酶切位點Ndel/ Hindlll和pET22b (+)在NosP的C-端插入組氨酸標簽，獲得重組質粒為pET22b-his-c ; 方案2 :借助酶切位點Nde I和Hindlll在NosP的N-端插入組氨酸標簽，獲得重組質粒為 pET28a-his-n ;方案2 :借助酶切位點BamH I和Xho I在NosP的N-端插入GST標簽，獲得 重組質粒為pGEX4T-gst-n.將上述重組質粒測序驗證后分別轉入E. coli BL21表達宿主 中，得到兩種基因重組E. coli，按照標簽的不同分別稱為pHC工程菌、pHN工程菌和pHG工 程菌。
[0016] 實施例2 將實施例1中得到的三種基因重組E. coli分別在50mL的LB培養基（含100 y g/mL 氨芐青霉素或50yg/mL卡那霉素）中，37°C、220rpm振搖過夜培養獲得相應的種子液。將 種子液按5%接種量轉接至1^培養基（含10〇11 §/1^氨芐青霉素或5〇11§/1^卡那霉素） 中，37°C振搖培養至培養液0D6QQ= 0. 8±0. 1時，加入終濃度為0. 001-2mM的誘導劑IPTG， 在25°C條件下，誘導培養20小時，得到工程菌株E. coli發酵液。在4°C、4500rpm條件下離 心15min收集發酵菌體，菌體經40mM的Tris-HCl緩沖液（pH 8. 0)洗滌兩次，收集菌體用 于SDS-PAGE分析。結果發現pHC、pHN和pHG三株工程菌均在0. 2mM IPTG條件下獲得最佳 可溶性表達量，NosP的含量分別占總蛋白量的8. 5%、7. 8%和7. 1%。
[0017] 實施例3 將實施例1中得到的三種基因重組E.Coli分別在50mL的LB培養基（含100yg/mL氨 芐青霉素或50yg/mL卡那霉素）中，37°C、220rpm振搖過夜培養獲得相應的種子液。將種 子液按5%接種量轉接至1^培養基（含10〇11 §/1^氨芐青霉素或5〇11§/1^卡那霉素）中， 37°C振搖培養至培養液0D6QQ= 0. 8±0. 1時，加入終濃度為0. 2mM的誘導劑IPTG，在10~ 37°C條件下，誘導培養20小時，得到工程菌株E. coli發酵液。在4°C、4500rpm條件下離心 15min收集發酵菌體，菌體經40mM的Tris-HCl緩沖液（pH 8. 0)洗滌兩次，收集菌體用于 SDS-PAGE分析。結果發現在16°C條件下pHC、pHN和pHG三株工程菌中NosP可溶性表達量 達到最大值，分別占總蛋白量的9. 3 %、8. 4 %和8. 1 %。
[0018] 實施例4 將實施例1中得到的三種基因重組E.coli分別在50mL的LB培養基（含100yg/mL氨 芐青霉素或50yg/mL卡那霉素）中，37°C、220rpm振搖過夜培養獲得相應的種子液。將種 子液按5%接種量轉接至1^培養基（含10〇11 §/1^氨芐青霉素或5〇11§/1^卡那霉素）中， 37°C振搖培養至培養液0D6QQ= 0. 8±0. 1時，加入終濃度為0. 2mM的誘導劑IPTG，在16°C 條件下，誘導培養8-24h小時，得到工程菌株E. coli發酵液。在4°C、4500rpm條件下離心 15min收集發酵菌體，菌體經40mM的Tris-HCl緩沖液（pH 8. 0)洗滌兩次，收集菌體用于 SDS-PAGE分析。在誘導16小時條件下pHC、pHN和pHG中NosP可溶性表達量已達到平臺 期，分別占總蛋白量的9. 5%、8. 8%和8.