一種草金魚腹鰭細胞系的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞生物學領域，具體涉及一種草金魚腹鰭細胞系的構建方法。
【背景技術】
[0002] 魚類細胞系經過多年的發展，各種淡水、海水魚類細胞系已成為多種學科領域重 要的體外研宄體系，許多重要實驗和新技術都需要在魚類細胞系的基礎上進行進一步研 宄。魚類細胞系的應用范圍日益廣泛，已從最初的病毒分離、提純、鑒定、體外繁殖擴展到環 境污染物致毒機理及其監測、魚類免疫、種質改良、資源保護等諸多領域。魚類細胞系不但 可作為在細胞生物學、魚類病毒學、魚類生理學、魚類免疫學、環境毒理學、魚類遺傳學、藥 理學等多種學科進行基礎研宄的良好的體外研宄體系，還可在魚類病毒疫苗研制，環境污 染物毒性檢測，魚類基因工程育種，魚類組織胚胎研宄，珍稀魚類資源保護，天然活性物質 開發等領域進行應用研宄。無論在理論研宄方面，還是實際應用方面，都具有深遠意義。
[0003] 觀賞魚的飼養在我國具有悠久的歷史，其中草金魚是我國觀賞魚中養殖量和出 口規模最大的品種之一。草金魚（Carassiusauratus)隸屬于鯉型目（Percoiformers)、 鯉科（Sparidae)、鯽屬（Carassius) ^Wolf和Quimby在20世紀60年代建立了世界 上第一株魚類細胞系，即虹鱒魚生殖腺細胞系RTG-2。目前已經報道的魚類細胞系有 300 余種(LakraWS,SwaminathanTR,JoyKP.Development,characterization,co nservationandstorageoffishcelllines:areview[J].FishPhysiologyand Biochemistiy，2011，37 (1) : 1-20)。其中已經報道的金魚的細胞株主要有GFSK-S1金魚腎 臟細胞系（DickyLY，ChowBKC，ChanCB，etal.Molecularcloningandexpression studiesofaprolactinreceptoringoldfish(Carassiusauratus) [J].Life sciences，2000, 66(7) :593-605)，GAKS金魚鱗片細胞系（AkimotoK，TakaokaT，Sorimachi K.Developmentofasimpleculturemethodforthetissuescontaminatedwith microorganismsandapplicationtoestablishmentofafishcellline[J]. Zoologicalscience，2000, 17(1) :61_63)，GFM金魚肌肉細胞系（Roug6eL，OstranderG K，RichmondRH，etal.Establishment,characterization,andviralsusceptibility oftwocelllinesderivedfromgoldfishCarassiusauratusmuscleandswim bladder[J] ?Diseasesofaquaticorganisms，2007, 77 (2) : 127)，GH金魚心臟細胞系 (CGMCCNO. 9334)，金魚尾鰭細胞系（HashimotoH，ToyoharaH，YokoyamaY，etal.Effects ofcarpserumonthegrowthofgoldfishfincellsinearlypassage[J].Journal offishbiology，1997, 50(1): 201-207)。
[0004] 細胞培養技術是生命科學領域，細胞工程、基因工程和生物醫學工程主要的研究 手段。魚類細胞系的構建為魚類病毒性疾病的病原學研究和病毒的疫苗研究提供了基礎的 生物學材料具有重要的研究價值。通過細胞株來鑒定和分離敏感病毒株是世界動物衛生組 織OfficeInternationalDesEpizooties(OIE)推薦的最有效方法，通過建立不同種類的 魚類細胞株為魚類病毒篩選敏感細胞系提供了豐富的生物學材料。目前，已構建的金魚細 胞系如上所述，而關于草金魚腹鰭細胞系還未見報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種草金魚腹鰭細胞系的構建方 法。
[0006] 本發明的第二個目的是，提供所述細胞系的用途
[0007] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：
[0008] 一種草金魚腹鰭細胞系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0009] 1)組織塊的處理：剪取草金魚腹鰭組織，于濃度為1000IU/ml青霉素-鏈霉素雙 抗溶液中浸泡30m分鐘，以75%酒精消毒處理，用濃度為2. 5ug/ml的兩性霉素B的D-PBS 沖洗3次，無菌條件下將腹鰭組織剪成1_3的組織塊，將組織小塊浸泡在在0. 25 %胰蛋白 酶和0. 02% EDTA中消化lOmin后，再用0. 5%透明質酸酶消化lh ;
[0010] 2)原代培養：將組織塊移植到底面積為25cm2的培養瓶中，保持溫度為26°C，于組 織塊移植后的第15小時加入2ml增殖培養液，第24小時加入3ml增殖培養液，每天半量更 換培養液一次；
[0011] 3)傳代培養：原代培養細胞長成單層后，加入胰蛋白酶靜置消化，然后用增殖培 養液懸起細胞，以1:2進行傳代，于26°C進行傳代培養。
[0012] 所述增殖培養液為含有18v/v%胎牛血清、15ng/ml人堿性成纖維生長因子、2ng/ ml表皮生長因子、lng/ml I性胰島素樣細胞生長因子、200IU/ml青霉素、200ug/ml鏈霉素、 0. 5ug/ml兩性霉素B、10mM 2-巰基乙醇的M199培養液。
[0013] 所述步驟3中加入的胰蛋白酶濃度為0.25%，消化時間為2min。
[0014] 分瓶傳代后，將培養瓶置于26°C的無二氧化碳的培養箱中培養5天即可長滿；穩 定傳代后，細胞呈典型的成纖維形態；該細胞系是一種特性穩定、成分均一的中國草金魚腹 鰭細胞系，是研宄水產動物病毒學和免疫學的良好材料。
[0015] 進一步地，所述金魚腹鰭細胞系具有以下生物學特性：
[0016] a.原代分離自組織塊附近的細胞，呈上皮樣細胞，傳代穩定后呈纖維樣細胞的形 態特點；
[0017] b.細胞增殖能力強，每一個組織塊在處理后3d左右均能分離出大量細胞，均具有 連續傳代的能力；
[0018] C.該細胞系培養條件為26°C恒溫細胞培養箱，無需二氧化碳。
[0019] 為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是：
[0020] 如上所述的草金魚腹鰭細胞系在檢測皰瘆病毒CyHV-2中的應用。
[0021] 本發明優點在于：
[0022] 1、本發明針對草金魚腹鰭細胞的特征，優化出適合該細胞生長增殖的培養基及適 宜的培養條件，成功構建了草金魚腹鰭細胞系；該細胞繁殖能力強，分瓶傳代后培養5天即 可長滿培養瓶。目前，該細胞系已連續傳代至60代以上，可提供大量的草金魚腹鰭來源細 胞。本發明的方法不僅可用于構建腹鰭組織細胞系，該方法還可適用于構建其他部位的鰭 組織細胞系（如胸鰭、背鰭、尾鰭等）。
[0023] 2、本發明所構建的腹鰭細胞系為分子細胞水平上展開魚類病毒感染途徑、感染機 理以及研制病毒疫苗等提供了基礎。
【附圖說明】
[0024] 附圖1為顯微鏡下的中國草金魚腹鰭組織塊附近迀移出的細胞（原代培養第3 天）。
[0025] 附圖2為顯微鏡下穩定傳代后的中國草金魚腹鰭細胞系。
[0026] 附圖3為含鯽魚皰瘆病毒II感染實驗結果。其中，圖3(A):正常的草金