一種克雷伯氏肺炎桿菌及其應用和一種生產1,3-丙二醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵領域，具體地，涉及一種克雷伯氏肺炎桿菌及其應用和一 種生產1，3-丙二醇的方法。
【背景技術】
[0002] 1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，可用作溶劑、抗凍劑、合成聚酯的單體以及合 成其他化學品的原料，特別是用作合成聚對苯二甲酸丙二酯的單體，其中，聚對苯二甲酸丙 二酯是一種性能優良的聚酯材料，有著廣闊的應用前景。目前1，3-丙二醇的生產成本相對 較高，限制了聚對苯二甲酸丙二酯的推廣應用，且1，3-丙二醇的工業化生產主要采用化學 合成法。近年來已研發了通過生物法合成1，3-丙二醇的技術，其中，生物法合成1，3-丙二 醇利用甘油等可再生資源，具有綠色環保等優勢，為1，3-丙二醇的工業化生產提供了一種 新的選擇。
[0003] 美國杜邦公司開發了一種利用大腸桿菌工程菌株以葡萄糖為原料發酵生產 1，3-丙二醇的方法。將來源于酵母的甘油合成途徑與來源于克雷伯氏肺炎桿菌的1，3-丙 二醇合成途徑轉入大腸桿菌，該工程菌株利用葡萄糖為原料，可以直接合成1，3-丙二醇， 并利用生產的1，3-丙二醇合成聚對苯二甲酸丙二酯，該技術獲得2003年美國總統綠色化 學獎。
[0004]自然界中很多野生微生物利用甘油為原料可以發酵合成1，3-丙二醇，包括丁酸 梭菌、梓檬酸菌、克雷伯氏肺炎桿菌、克雷伯氏產酸桿菌等。由于克雷伯氏肺炎桿菌生產 1，3-丙二醇具有產物濃度高，生產強度大等優點，是廣泛關注的一種1，3-丙二醇生產菌 株。但是克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油發酵合成1，3-丙二醇的過程中，還同時合成琥珀酸、 乳酸、乙酸、2, 3- 丁二醇、乙醇等副產物，影響甘油向1，3-丙二醇的轉化率和生產強度，同 時也為1，3-丙二醇的分離提取帶來負擔。利用現有技術中已有的克雷伯氏肺炎桿菌發酵 合成1，3-丙二醇時，甘油向1，3-丙二醇的轉化率一般僅為0. 30-0.42g/g，生產強度一般僅 為1. 0-1. 8gAL ? h)，甘油向1，3-丙二醇的轉化率和生產強度都有待提高。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了克服現有技術中的上述缺陷，提供一種克雷伯氏肺炎桿菌及 其應用和一種生產1，3-丙二醇的方法，采用本發明的克雷伯氏肺炎桿菌發酵合成1，3-丙 二醇時，能夠明顯降低副產物乳酸和乙醇的濃度，明顯提高甘油向1，3-丙二醇的轉化率和 生產強度。
[0006] 為了實現上述目的，本發明的發明人進行了大量的篩選實驗，結果篩選到一株在 發酵合成1，3-丙二醇時，能夠明顯降低副產物乳酸和乙醇的濃度，明顯提高甘油向1，3-丙 二醇的轉化率和生產強度的克雷伯氏肺炎桿菌，因此，第一方面，本發明提供了一種克雷伯 氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)，所述克雷伯氏肺炎桿菌保藏于中國典型培養物保 藏中心，保藏號為CCTCC NO :M 2015108。
[0007] 第二方面，本發明提供了上述克雷伯氏肺炎桿菌在生產1，3-丙二醇中的應用。
[0008] 第三方面，本發明提供了一種生產1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：將上述克 雷伯氏肺炎桿菌進行發酵培養以產生1，3-丙二醇。
[0009] 利用本發明的保藏號為CCTCC NO :M 2015108的克雷伯氏肺炎桿菌，以甘油為 原料生產1，3-丙二醇時，甘油向1，3-丙二醇的轉化率可高達0. 54g/g，生產強度可高達 2. 59gAL ? h)，能夠明顯降低副產物乳酸和乙醇的濃度，明顯提高甘油向1，3-丙二醇的轉 化率和生產強度，且能夠大大降低分離提取1，3-丙二醇的負擔。
[0010] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0011] 生物保藏
[0012] 本發明的克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)于2015年3月13日被 保藏在中國典型培養物保藏中心（縮寫為CCTCC，地址：湖北省武漢市洪山區八一路武漢大 學，中國典型培養物保藏中心，郵政編碼：430072)，保藏編號為CCTCC NO :M 2015108。
【具體實施方式】
[0013] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0014] 第一方面，本發明提供了一種克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)，該克 雷伯氏肺炎桿菌保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M 2015108。
[0015] 其中，本發明的克雷伯氏肺炎桿菌的分離過程可以包括：采集江蘇省張家港市水 稻種植田地表以下20厘米處的土壤樣品50-60g，用200-250ml蒸餾水懸浮混勾，將混合樣 品自然沉降1-2小時，然后取上清液100_150ml，在4000-6000rpm下離心20-30分鐘，倒去 上清液，用5-10ml無菌水重懸沉淀。將沉淀懸液涂布于固體培養基，在30-37°C培養24小 時。
[0016] 對于固體培養基的組成沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種固體培養基， 優選情況下，以1L固體培養基計，所述固體培養基組成為：甘油40g，K 2HP04 ? 3H20 3. 20g， KH2P04 1. 20g，NH4C1 2. 85g，Na2S04 0? 28g，MgS04 ? 7H20 0? 10g，檸檬酸 0? 42g，酵母膏 2. OOg 和瓊脂粉20g。
[0017] 培養24小時后，挑選20-30個無絨毛、透亮、直徑為l-2mm的菌落。挑取各菌落并 分別接入至500ml錐形瓶中進行培養，每個錐形瓶中均裝有100-150ml發酵培養基，且均加 有0. 5-lg無菌碳酸鈣。培養時，恒溫振蕩器轉速為150-250rpm，溫度為30-37°C，發酵培養 12小時后，通過氣相色譜儀和液相色譜儀對每個錐形瓶中的發酵液中的產物和副產物進行 分析。
[0018] 其中，以1L發酵培養基計，發酵培養基的組成為：甘油40g，K2HP0 4 ? 3H20 3. 20g， KH2P04 1. 20g，NH4C1 2. 85g，Na2S04 0? 28g，MgS04 ? 7H20 0? 10g，檸檬酸 0? 42g，酵母膏 2. OOg 和微量元素〇. 3mL，其中，以1L微量元素計，微量元素的組成為：ZnCl2 7. 56g，FeCl3 ? 6H20 15. 65g，MnCl2 ? 4H20 6. 28g，CuC12 ? 2H20 1. 32g，CoC12 ? 6H20 6. 42g，H3B03 0? 48g 和 Na2Mo04 ? 2H20 3. 22g〇
[0019] 其中，氣相色譜儀（型號為GC-2014C，購自日本島津公司），色譜柱采用毛細管 柱AT. SE-54(30mX0. 53mmX1.0ym)，FID檢測器，N2載氣，柱溫為120°C，檢測器溫度為 250 °C〇
[0020] 液相色譜儀（型號為LC-20A，購自日本島津公司），色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-Aq(4. 6mmX 150mmX5 y m)，流動相為 0? 005mol/L H2S04,流速為 1.0ml/min，柱溫箱為 65°C〇
[0021] 其中，一個錐形瓶中的發酵液的檢測結果為：甘油為11. lg/L，l，3-丙二醇為 16. 3g/L，2, 3- 丁二醇為0. 4g/L，乙醇為0. lg/L，乳酸為0. 4g/L，乙酸為0. 5g/L，琥珀酸為 0. lg/L。原料甘油向1，3-丙二醇的轉化率為0. 56g/g。甘油向1，3-丙二醇的轉化率的計 算公式為：
[0022] 發酵結束時1，3 -丙二醇的最終濃度Q /乃x發酵結束時發酵液的體積U) 發酵過程中消耗的甘油總量(g) °
[0023] 將該菌落提取菌株總DNA，進行16sRNA基因序列分析，其16sRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示，結果表明該菌為克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)，命名為克雷 伯氏肺炎桿菌HM-B2。將該克雷伯氏肺炎桿菌保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為 CCTCC NO :M 2015108。
[0024] 第二方面，本發明提供了上述克雷伯氏肺炎桿菌在生產1，3-丙二醇中的應用。
[0025] 第三方面，本發明提供了一種生產1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：將上述克 雷伯氏肺炎桿菌進行發酵培養以產生1，3-丙二醇。
[0026] 本發明的生產1