一種烷烴降解酶制劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于環境微生物技術領域，特別涉及一種烷烴降解酶制劑及其制備方法和 應用。
【背景技術】
[0002] 石油烴類污染已經成為全世界范圍內的重要的環境污染問題之一。石油是由數百 種化合物組成的復合體，烷烴作為石油最重要的成分之一，占石油總質量的20-50%以上。 在自然環境中，短鏈烷烴易揮發，中鏈烷烴可以被微生物降解，而不易揮發、低溶解性的長 鏈烷烴和環烷烴則屬于很難被生物降解的污染物，對環境的危害較持久，因此環境中烷烴 的去除一直以來都是研宄的熱點。
[0003] 去除烷烴的方法主要包括物理、化學和生物等方法。其中，生物方法具有不造成二 次污染、費用低、原位降解污染物等特點，是一種極有前途的技術。目前已經報道的烷烴降 解微生物主要有假單胞菌、不動桿菌、諾卡氏菌、紅球菌等，但高效廣譜降解菌株少，其中大 多數菌株降解譜為C 1(|-C2(l烷，而少數降解譜較寬的菌株如諾卡氏菌降解原油中長鏈烷烴的 效率則較低。而且用于環境修復的外源微生物引進土壤環境后，容易受到土著微生物的競 爭、排斥，影響其存活、繁殖。因此需要建立一種高效廣譜降解烷烴強化生物修復方法。
[0004]國內外研宄表明，微生物分泌的酶是降解有機污染物的決定因素。微生物降解酶 主要有兩種，分別為胞內酶和胞外酶。許多研宄發現，降解有機物的酶主要位于胞內。因此， 破碎微生物細胞而釋放出酶液，對于利用有機污染物降解至關重要。與投放活體微生物相 比，投放降解酶具有以下優勢：（1)不需要對環境的適應期；(2)對環境適應的范圍比微生 物本身要廣，如pH、溫度、濕度等；（3)無論環境污染物的濃度大小，酶對底物均具有專一、 高效性；(4)容易進入土壤空隙與底物結合，而且酶活容易控制；（5)受代謝產物的抑制作 用較小。因此酶和酶技術在環境有機污染治理方面具有廣泛的前景。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種烷烴降解酶制劑及其制備方法和應用。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種烷烴降解酶制劑，烷烴降解酶制 劑為經破碎處理后的地衣芽孢桿菌發酵培養物；
[0007] 所述地衣芽抱桿菌PS5 (Bacillus licheniformis PS5)已于2011年7月19日保 藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M2011261。
[0008] 將地衣芽孢桿菌接種到含有烷烴的無機鹽液體培養基中發酵培養，收集菌體后 超聲破碎即得烷烴降解酶制劑。
[0009] 將體積百分比5-10%的地衣芽孢桿菌接種于含有烷烴的無機鹽液體培養基中，于 25-30°C，150-200rpm/min振蕩培養48-60h ;而后按體積百分比5-8%的接種量將培養液 接種到含有烷烴的無機鹽液體培養基中，于25-28°C發酵到對數生長期；于6000-8000rpm/ min下離心5-10min收集菌體；
[0010] 將收集的菌體用5-10倍體積的pH 6.0的PBS緩沖液重懸菌體，然后進行超 聲波破碎，超聲功率為200-500W，超聲破碎時間為25-35min ;然后在2-8 °C條件下，經 6000-8000rpm/min離心5-10min，取上清液，即為燒徑降解酶制劑。
[0011] 所述含有烷烴的無機鹽液體培養基組成為：正十六烷〇. 5-2. Og/L，環十二烷 0. 2-0. 5g/L,0. 5g/L NaCl,0. 2g/L MgS04,0. 5g/L(NH4)2S04,1. 5g/L K2HP04,0. 5g/L KH2P04, 0? 05g/L CaCl2,0? 02g/L FeS04,0? 002g/L 酵母粉，PH 值 7. 0。
[0012] 所述 PBS 緩沖液由 16ml 0. 2mol/L NaH2P(VK溶液和 84ml 0. 2mol/L 恥2冊04水溶 液混合制成。
[0013] 所述酶制劑作為污染環境中的烷烴降解酶制劑，用于治理污染環境。
[0014] 所述酶制劑用于降解污染水體或土壤中的烷烴。
[0015] 所述酶制劑中加入2_4mmol/L的Fe2+或2_4mmol/L摩爾比為1:1的Fe 2+/Fe3+，施 用于污染水體或土壤中進行降解烷烴，進而達到修復的目的。
[0016] 本發明的優點是：
[0017] 1.本發明的酶制劑含有參與烷烴降解的多種酶，施用于受污染的水體或土壤后可 直接對烷烴進行降解，具有效率高、成本低的特點，較微生物降解速度提高40-60倍。
[0018] 2.本發明制劑較降解微生物受環境影響小，不需要對環境的適應期，可保持較高 的生物活性，可以將烷烴徹底的降解為〇) 2和H 20。
[0019] 3.輔助金屬離子的添加進一步提高酶劑作用效率。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明實施例提供的不同金屬離子鹽溶液對水相中酶制劑對烷烴降解作 用的影響效果圖；
[0021] 圖2為本發明實施例提供的不同金屬離子鹽溶液對土壤中酶制劑對烷烴降解作 用的影響效果圖；
[0022] 圖3為本發明實施例提供的烷烴降解酶劑與電動修復組合修復烷烴污染土壤效 果圖。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1、烷烴降解酶制劑的制備及其對水體中烷烴的降解
[0024] 1)烷烴降解酶制劑的制備
[0025] 選取烷烴高效降解菌株地衣芽孢桿菌進行種子液培養，將單克隆菌種接種到含 有烷烴的無機鹽液體培養基中，于28°C，180rpm/min振蕩培養60h;而后按體積百分比5% 的接種量將上述培養的菌種重新接種到含有烷烴的無機鹽液體培養基內振蕩培養，于28°C 發酵到對數生長期（0D 6CICI= 0. 6);將發酵液于6000rpm/min下離心10min，收集菌體。
[0026] 收集的菌體用10倍體積的pH 6. 0的PBS緩沖液重懸菌體，然后進行超聲波破碎， 處理條件為300W功率下超聲3s，停止3s，超聲破碎時間為30min ;然后在4°C條件下，經 8000rpm/min離心10min，取上清液，即為燒徑降解酶制劑。
[0027] 地衣芽孢桿菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)保藏于中國典型培養物保藏 中心，保藏編號為CCTCC N0:M 2011261，保藏日期為2011年7月19日，保藏單位地址為中 國.武漢.武漢大學。
[0028] 含有烷烴的無機鹽液體培養基成分為：正十六烷0. 5g/L，環十二烷0. 3g/L，0. 5g/ L NaCl，0.2g/L MgS04,0.5g/L(NH4)2S04，1.5g/L K2HP04,0.5g/L KH2P04,0.05g/L CaCl2， 0? 02g/L FeS04,0? 002g/L 酵母粉，PH 值 7. 0。
[0029] 所述PBS緩沖液由16ml0.2M NaH2P(VK溶液和84ml0.2M Na2HP04水溶液混合制 成。
[0030] 采用考馬斯亮藍法（Bradford法）測定酶制劑蛋白質濃度，采用牛血清蛋白（BSA) 配制成標準蛋白質溶液，依據外標法對粗酶蛋白濃度進行定量分析，經測定，粗酶蛋白濃度 為 L 5mg/L〇
[0031] 2)烷烴降解酶制劑對水體中烷烴的降解
[0032] 烷烴污染水體中酶制劑降解活性測定反應體系為：3mg酶制劑、20ml0. 2M pH 7. 5 的PBS緩沖液、500mg/L混合烷烴（250mg/L正十六烷和250mg/L環十二烷）、濃度均為 2mmol/L 的 Fe2+(FeS04)和 Fe3+(FeCl3);以及濃度之和為 2mmol/L 的 Fe2+/Fe3+(FeS04/FeCl3) (1:1)混合物。以只加酶制劑和只加PBS緩沖液的反應體系作為對照，32°C反應4h，試驗重 復二次。
[0033] 水相中混合烷烴的殘留采用有機相與水相間的液-液萃取方法，選用二氯甲烷作 為萃取劑進行烷烴浸提，采用氣相色譜（安捷倫7890)進行定量測定。
[0034] 測定結果（圖1所示）表明：與只加PBS緩沖液處理PBS-CK相比，加酶制劑和鐵 離子處理（En、En_Fe 2+、En_Fe3+和En-Fe 2+/Fe3+)對正十六燒和環十二燒均有較好的降解效