一種鷹嘴豆多肽部位的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鷹嘴豆多肽部位的制備方法及其應用，是利用鷹嘴豆豆瓣、鷹嘴 豆渣為原料制備的具有抗菌活性的多肽部位，具有抗細菌、抗真菌等生物活性，在醫藥、食 品領域具有很好的應用前景。
【背景技術】
[0002] 抗生素的發現曾是人類醫學史上的一個里程碑。然而，由于抗生素的濫用而不時 地引起耐藥菌的出現，而且出現的頻率超過新型抗生素的開發速度，使得許多曾經高度有 效的抗生素藥物失效，以至于給感染性疾病的治療帶來諸多新的問題，傳統抗生素的使用 正面臨著嚴峻的挑戰。研宄和應用無毒、無公害、無耐藥的新型抗菌制劑替代抗生素已成發 展趨勢。
[0003] 植物在生長過程中每天要與環境中幾百萬種的病原菌接觸，隨時都可能遭受微生 物的侵襲，而植物沒有象哺乳動物那樣特異的免疫系統，因而非特異的天然免疫體系對植 物起著重要的保護作用。人們發現，生物受到微生物感染后，迅速、大量產生具有抗菌活性 的小分子多肽（即抗菌肽）參與機體免疫。抗菌肽幾乎是所有生物中都有的重要免疫分子， 是植物非特異天然免疫體系的重要組成部分。目前已從微生物、植物、昆蟲、節肢動物、兩棲 動物、哺乳動物甚至人體內鑒定出上千種抗菌肽，這類抗菌肽在合成機制、氨基酸組成和作 用機制等方面不同于傳統的微生物（包括細菌、真菌和鏈霉菌等）產生的多肽類抗生素。抗 菌肽作為傳統抗生素的可能替代物以其無比優越的特性越來越成為人們關注的熱點。抗菌 肽（antibacterial peptide, ABP)又稱抗微生物肽（antimicrobial peptide, AMP)或肽抗 生素（peptide antibiotics)，是廣泛存在于自然界生物中的一種具有抗茵、抗病毒、抗寄 生蟲、提高機體免疫力等生物學功能的活性多肽，它是生物非特異性防御系統的免疫應答 產物，具有廣譜抗菌活性，不僅可以抑制多種細菌或真菌，甚至可以在不傷及正常細胞的情 況下抑制動物體內的腫瘤細胞。抗菌肽是機體天然免疫系統的重要組成部分，并能夠在機 體發生特異性免疫應答之前發揮抗感染作用。目前，抗菌肽的研宄和開發已成為國內外研 宄的熱點之一。抗菌肽具有廣譜抗菌和其它優良的特性，與它自身的結構特點密不可分。雖 然抗菌肽種類繁多，來源也不同，但它們的一級結構（即氨基酸序列）具有較強的保守性。 抗菌肽相對分子質量小（〈10KD左右）。而植物抗菌肽一般為40-90個氨基酸殘基組成的多 肽，富含半胱氨酸，通常具有數個折疊和一段a-螺旋結構。不同來源、不同結構的抗 菌肽的一級結構（即氨基酸序列）具有較強的保守性，且具有以下共同特點：
[0004] ①N端富含極性氨基酸，如賴氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)等，呈強堿性，含過剩的正 電荷，使抗菌肽呈陽離子特性，這一特征使抗菌肽具有表面活性劑活性；；②C端通常酰胺 化，呈中性疏水性，富含丙氨酸（Ala)、纈氨酸（Val)、甘氨酸（Gly)等非極性氨基酸，這可能 與抗菌肽的廣譜抗菌活性有關；③中間連接部分富含脯氨酸（Pro)，末端大多酰胺化，它也 直接影響抗菌肽的殺菌活性；④大部分抗菌肽在第二位上的氨基酸為色氨酸（Trp)，它對 抗菌肽的殺菌活性的高低起著至關重要的作用。
[0005] 傳統抗生素是通過消除微生物生長或生存必需的功能，如阻撓細菌蛋白質的合成 或者改變酶的活性來達到殺菌目的，而細菌通過改變一種基因就足以對付抗生素的這種進 攻。抗菌肽則作用于細菌細胞膜，導致膜的通透性增大，以此穿透、殺滅細菌。細菌必須改 變膜的結構，即改變相當部分的基因才能防御抗菌肽的進攻，而這幾乎是不可能的。因此， 抗菌肽極大地減少了產生耐藥性的可能，這也是與抗生素相比的一大優勢。抗菌肽是動物 機體分泌的小分子短肽，也是機體成分之一，因此具有安全無毒副作用的生物學特性，從而 避免了傳統抗生素類藥物對機體免疫系統的損害。抗菌肽在100°c加熱lOmin條件下仍能 保持活力，對pH值有較強適應性，水溶性好。抗菌肽對正常的真核細胞幾乎沒有殺傷作用， 只作用于原核細胞和發生病變的真核細胞。其原因在于：
[0006] 由于高等動物細胞膜上有大量的膽固醇和蛋白質，特別是前者，阻礙抗菌肽的疏 水面插入磷脂雙分子層中。
[0007] 哺乳動物細胞膜外層脂質為其所特有的呈電中性的兩性磷脂，主要是卵磷脂和鞘 磷脂；而細菌細胞膜則含有大量的帶有負電荷的磷脂（如磷脂酰甘油和心磷脂），且有時其 含量會超過50 %，使其必然暴露于細胞外膜；此外，革蘭陰性菌細胞壁主要由帶大量負電 荷的脂多糖組成。
[0008] 可能是由于微生物與高等動物細胞膜的膜外結構的區別：高等動物細胞膜外表面 的唾液酸與膜的距離有80 A，它可能與抗菌肽的帶正電區結合而阻止抗菌肽接近細胞膜發 揮殺傷作用。
[0009] 哺乳動物的真核細胞中存在著高度發達的細胞骨架系統，其中的微絲和微管與細 胞膜內層有許多結合位點，這種結構是維持細胞特殊形狀和滲透壓的首要因素，高度發達 的細胞骨架系統，在哺乳動物細胞對抗菌肽溶胞作用的敏感性上發揮著重要作用。
[0010] 目前食品工業中的防腐劑主要以山梨酸、苯甲酸及其鹽類等化學合成劑為主，此 類化合物容易在加工過程中超標而對人體造成危害。抗菌肽用作食品防腐保鮮劑不僅具有 廣譜抗菌活性、有效殺滅霉腐微生物，而且抗菌肽分子量較小、熱穩定性強、水溶性好、無 免疫原性、對人無毒副作用，另外抗菌肽在人體內還可以被蛋白酶降解，雙重安全的保證使 得抗菌肽在食品工業領域逐漸顯示出廣闊的應用前景。
[0011] 醫藥工業是抗菌肽應用最為廣泛和最有前途的行業，隨著抗生素的長期廣泛應 用，許多病源菌對它們產生了耐藥性，抗生素添加劑的使用則嚴重破壞了動物腸道的微生 物平衡，且易在動物體內殘留，嚴重影響畜產品質量和人類健康，而具有廣譜抗菌且有獨特 抗菌機制的抗菌肽顯然在這方面的應用研宄中具有明顯優勢。隨著人們對抗菌肽結構與活 性的關系、抗菌肽作用機制及其基因表達調控機制認識的不斷深入，將抗菌肽與病原體表 面特異受體結合的配體連接，完全有可能設計出一批能夠特異作用于腫瘤、真菌或病毒的 高效肽類抗生素、抗腫瘤藥物、抗病毒藥物，使人類擺脫此類疾病的折磨，給醫藥衛生的發 展和疾病治療帶來不可估量的現實意義。
[0012] 癌癥是人類疾病中的一大難題，目前使用的化療藥物能殺死癌細胞，但也同時殺 死人體內正常細胞，副作用極大。抗菌肽能抑制某些腫瘤細胞的生長而對人體正常細胞無 害，極有可能成為無毒或低毒的抗腫瘤新藥，這給抗癌藥物的開發帶來了希望。
[0013] 抗菌肽在化妝品上用作防腐劑，魚類抗菌肽不僅是營養成分，更重要的是它的抗 菌和美容作用，比化學防腐劑用于化妝品具有獨特的優勢和廣泛的市場潛力。
[0014] 抗菌肽在農業和畜牧業中的應用：1、抗菌肽作為飼料添加劑普通抗生素的作用具 有專一性，而且容易使機體產生抗藥性，導致產生的作用效果不佳。抗菌肽不僅具有廣譜抗 菌作用，而且對畜禽具有促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌 耐藥性的一類環保型制劑，可作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代目前飼養動物所用的抗 生素，減少抗生素對動物體的危害以及減少動物養殖中對藥物的依賴。2、轉基因動物借鑒 已成功的昆蟲抗菌肽轉基因工程，如轉基因蚊子、轉基因馬鈴薯、轉基因水稻等，把特異的 抗菌肽基因轉入畜禽特定細胞讓其表達，從而產生抗病新品種，開辟了一條發展畜牧生產 的新思路。3、在綠色畜牧業發展中發揮重要作用：由于抗生素在畜禽生產中的大量的使用。 藥物在畜禽體內嚴重殘留及其耐藥微生物的產生使動物性食品的安全性問題日益突出，這 嚴重威脅著人民身體健康和整個養殖業的可持續發展，也給我國畜產品出口貿易帶來了巨 大的損失。抗菌肽具有廣譜抗菌活性且快速殺菌，不受傳統抗生素耐藥突變株影響，不易產 生耐藥菌株，與傳統抗生素協同作用，中和內毒素和在動物體內起有效作用等特性。所以在 綠色、安全、環保的畜牧業發展中，抗菌肽也發揮著重要的作用。
[0015] 抗菌肽在植物領域的研宄與應用:植物病害多達數百種，幾乎所有作物在生長期 內都會遭到不同程度的危害，培育抗病新品種是防治植物病害的根本途徑。抗菌肽具有廣 譜殺菌效果及不易引起病原微生物產生耐藥性等優點。因而，將抗菌肽基因轉入農作物，是 培育作物抗病新品種的有效策略。
[0016] 抗氧化劑和抗氧化多肽：隨著人們生活水平提高和生活方式的改變，