一種山羊病原三重pcr檢測引物及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種可同時檢測山羊痘病毒、山羊魏氏梭菌和山羊支原體的山羊病原三重PCR檢測引物及檢測方法。
技術背景
[0002]山羊痘是由山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)引起的急性、熱性、接觸性傳染病，在皮膚上發生丘瘆-膿皰性痘瘆。魏氏梭菌，又稱產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)屬于腐生性厭氧芽孢致病菌，是引起山羊“猝死癥”的主要病原，該菌分A、B、C、D、E 5個不同的菌型，α毒素是由其共同產生的一種壞死、致死性毒素，有人認為α毒素是家畜“猝死癥”的主要致病因子。山羊支原體性肺炎(mycoplasmal pneumonia of sheepand goats)又稱羊傳染性胸膜肺炎，是由多種支原體引起的一種高度接觸性傳染病，其臨診特征為高熱、咳嗽，胸和胸膜發生漿液性和纖維素性炎癥，取急性或慢性經過，病死率很尚O
[0003]隨著養殖規模的不斷擴大，集約化程度的提高，山羊養殖過程中山羊疾病呈現非典型化和復合感染的趨勢。目前用于山羊致病病原的鑒定包括分離培養和電鏡觀察，這是一個對操作有較高要求又耗時漫長的過程，免疫學診斷方法包括中和試驗、瓊脂凝膠免疫擴散試驗、對流免疫電泳、反向被動血凝試驗、乳膠凝集試驗、單擴溶血試驗或ELISA等診斷方法靈敏度較低。目前市場上羊病診斷的PCR檢測技術大多以單重PCR或者單一種類病原(病毒或細菌)PCR為主，而以病毒、細菌、支原體同時進行PCR反應的技術尚未見報道。因而，不同種類病原之間多重PCR技術的應用，迄今還是一個空白。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種可同時檢測山羊痘病毒、山羊魏氏梭菌和山羊支原體的山羊病原三重PCR檢測引物及檢測方法，可用于單管同時檢測山羊痘病毒、山羊魏氏梭菌、山羊支原體感染，用于臨床對可疑感染患畜進行病原學鑒別診斷。
[0005]本發明提供一種可同時檢測山羊痘病毒、山羊魏氏梭菌和山羊支原體的山羊病原三重PCR檢測引物，包括:
[0006]山羊痘病毒上游引物:5’-CTCATTGGTGTTCGGATT-3’
[0007]山羊痘病毒下游引物:5’-ATGGCAGATATCCCATTA-3’
[0008]山羊魏氏梭菌上游引物:5’-TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG-3’
[0009]山羊魏氏梭菌下游引物:5’-CATAATCCCAATCATCCCAACTA-3’
[0010]山羊支原體上游引物:5’-ACTATGAGATGGGGATGCGGC-3’
[0011]山羊支原體下游引物:5’-GGACTTTAACCTCAAACTTGC-3’。
[0012]本發明還提供一種可同時檢測山羊痘病毒、山羊魏氏梭菌、山羊支原體的山羊病原三重PCR檢測方法:取ExTaq酶置于PCR反應管中，然后將山羊痘病毒上、下游引物，山羊魏氏梭菌上、下游引物和山羊支原體上、下游引物置于同一反應管中，然后取待檢樣本DNA模板置于所述反應管中，最后向所述反應管中加入雙蒸水，蓋好PCR反應管蓋，立即進行PCR擴增反應。
[0013]進一步的，所述山羊痘病毒上、下游引物，山羊魏氏梭菌上、下游引物，山羊支原體上、下游引物包括上述山羊痘病毒、山羊魏氏梭菌和山羊支原體的山羊病原三重PCR檢測引物。
[0014]進一步的，所述ExTaq酶為15 μ I，所述山羊痘病毒上、下游引物均為0.5 μ 1、所述山羊魏氏梭菌上、下游引物均為0.5 μ 1、所述山羊支原體上、下游引物均為0.5 μ 1，所述待檢樣本DNA模板為3 μ I，所述雙蒸水為4 μ I。
[0015]進一步的，所述山羊痘病毒上、下游引物濃度均為5.4 μπιο?/? ;山羊魏氏梭菌上、下游引物濃度均為2.0 μηιο1/1 ;山羊支原體上、下游引物濃度均為2.0 ymol/lo
[0016]進一步的，所述三重PCR擴增反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性50s，55°C退火50s，72°C延伸lmin，35循環數；72°C延伸6min。
[0017]本發明的有益效果在于:本發明涉及了三對PCR引物分別特異性擴增山羊痘病毒、山羊魏氏梭菌、山羊支原體基因序列，三對PCR引物可在同一 PCR反應管里同時進行擴增，實現多重檢測，大大縮短檢測時間，操作簡便。特異性引物的設計保證了引物高度保守和特異性，避免了引物與DNA模板之間無互補配對或交叉擴增的情況。
【附圖說明】
[0018]圖1所示為山羊痘病毒P32基因擴增產物；
[0019]圖2所示為山羊魏氏梭菌α毒素cpa基因擴增產物；
[0020]圖3所示為山羊支原體16S rRNA基因擴增產物；
[0021]圖4所示為山羊痘病毒P32基因、山羊魏氏梭菌α毒素cpa基因、山羊支原體16SrRNA基因擴增產物。
【具體實施方式】
[0022]下文將結合具體附圖詳細描述本發明具體實施例。應當注意的是，下述實施例中描述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達到更好的技術效果。
[0023]實施例1:
[0024]以臨床分離的3株山羊痘病毒、3株山羊魏氏梭菌、3株山羊支原體為被檢物，用現有的DNA提取方法制備其DNA模板。
[0025]根據山羊痘病毒P32基因設計合成的山羊痘病毒引物序列為:
[0026]P32-F:5> -CTCATTGGTGTTCGGATT-3’
[0027]P32-R: 5，-ATGGCAGATATCCCATTA-3，。
[0028]根據山羊魏氏梭菌α毒素cpa基因設計合成的魏氏梭菌引物序列為:
[0029]cpa-F:5’ -TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG-3’
[0030]cpa-R: 5，-CATAATCCCAATCATCCCAACTA-3，。
[0031]根據山羊支原體16S rRNA基因設計合成的山羊支原體引物序列為:
[0032]16S rRNA-F:5，-ACTATGAGATGGGGATGCGGC-3，
[0033]16S rRNA-R:5’ -GGACTTTAACCTCAAACTTGC-3，。
[0034]所述山羊痘病毒上、下游引物的濃度均為5.4 ymol/L，所述山羊魏氏梭菌上、下游引物的濃度均為2.0 μmol/L，所述山羊支原體上、下游引物的濃度均為2.0 ymol/L。
[0035]所述三重PCR反應步驟為25 μ 1:將15 μ I的ExTaq酶，0.5 μ I的山羊痘病毒上游引物、0.5μ1的山羊痘病毒下游引物、0.5μ I的山羊魏氏梭菌上游引物、0.5μ I的山羊魏氏梭菌下游引物和0.5 μ I的山羊支原體上游引物、0.5 μ I的山羊支原體下游引物，4 μ I的雙蒸水置于PCR反應管中，然后加入3 μ I上述待檢DNA模板進行三重PCR反應。
[0036]所述三重PCR的反應條件為:95°C預變性5min ;95