用于ret融合基因檢測的引物、探針及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于RET融合基因檢測的引物、探針及 檢測試劑盒。
[0002]
【背景技術】
[0003] 肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率居各種癌癥之首。每年 全世界有超過130萬的患者死于肺癌，近一半發生在發展中國家。據2010年我國衛生部 的統計，肺癌死亡率為30. 83/10萬，肺癌已經成為發病率和死亡率第一位的惡性腫瘤。 (Orras JM, Fernandez E, Gonzalez JR, et al. Lung cancer mortality in European regions(1955-1997). Ann Oncol, 2003, 14(1) :159-161;中華人民共和國衛生部，《2010年 中國衛生統計》年鑒)。
[0004] 肺癌從組織病理學上可以分為小細胞肺癌（SCLC)和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)兩大類，其中非小細胞肺癌約占肺癌總病例的85%。在我國肺 癌患者5年生存率僅為13%，其主要原因是大多數肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測 和確診技術，以及與之相配的科學治療方案，從而使患者錯失了治療的最佳時機。
[0005]目前化療仍是肺癌的主要治療手段，然而多數化療會產生較大的毒副作用，不同 患者間的化療效果會有較大差異。隨著腫瘤分子生物學的發展，肺癌的分子靶向治療因其 特異性高，毒副作用低，日益成為臨床醫生首選治療方式。RET基因為原癌基因，定位于第 10號外顯子的qll. 2位置，編碼一個受體酪氨酸激酶。研宄發現，RET基因在乳頭狀甲狀腺 癌和非小細胞肺癌中還可以和0〇?：6，％(^4，？服41?認，11?頂24，6011^5，11?頂33，1〇^1， ERC1, MBD1 和 TRIM27發生融合，激活下游RAS/MAPK/ERK, PI3K/AKT,和 phospholipase 〇 信號途徑，引起癌癥的發生（Gainor JF，Shaw AT，The 0ncologist2013;18:865 - 875 )〇
[0006] 以卡博替尼、凡德他尼為代表的藥物是針對RET基因融合突變開發的小分子靶向 藥物，通過抑制RET酪氨酸激酶區域的活性，阻斷其下游異常信號通路，從而抑制腫瘤細胞 的生長。臨床研宄表明卡博替尼對RET融合突變患者的有效率可達61%以上，而對野生型 的患者幾乎沒有療效。因此，檢測RET融合突變情況是指導卡博替尼類藥物用藥的前提和 基礎，在治療之前通過高敏度的檢測方法檢測RET融合基因突變對于提高患者的生存率， 延長生存期，提高生存質量有著重要意義。
[0007] 目前，RET融合突變的檢測方法主要為熒光原位雜交（FISH)法，然而FISH法檢 測特異性差，靈敏度低，檢測時間長。此外，FISH檢測需要昂貴的專用儀器設備，試劑成本 較高，操作復雜，使臨床檢測廣泛使用受到了限制。FISH檢測要求檢測樣本保存時間不宜 過長，采用保存時間長的樣本進行檢測會導致假陰性的發生，影響了檢測的準確性。因此， FISH檢測法無法滿足臨床醫生檢測實際應用的需求，臨床迫切需要開發一種高靈敏度的可 以同時檢測RET多種基因融合的檢測方法，以實現快速對RET多種融合突變進行同時檢測， 從而為臨床肺癌個體化治療方案提供科學參考依據。
[0008]
【發明內容】
[0009] 本發明的目的：提供一種用于RET融合基因檢測的引物、探針及檢測試劑盒，可以 一次同時檢測RET基因的17種融合突變，檢測靈敏度高，檢測時間只需90分鐘即可完成， 同時具備了靈敏度高，特異性好，廉價快速，操作簡單等優點，可以滿足臨床快速檢測的實 際需求。
[0010] 為了實現上述目的，本發明的技術方案是： 一種用于RET融合基因檢測的引物、探針，包括RET融合突變特異性反轉錄引物及RET 基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列；所述的RET融合突變特異性反轉錄引物 具體為： RET 反轉錄 1 : TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO ：01 RET 反轉錄 2 : CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO ：02 RET 反轉錄 3 : CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：03 Actin 反轉錄 4: CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO ：04〇
[0011] 所述的RET基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列包括KIF5B和RET-12 基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列、（XD1、（XD2、ERC和RET-12基因融合突 變檢測特異性引物和探針核苷酸序列、G0LGA7F、NC0A8F、H00K11F和RET-12基因融合突變 檢測特異性引物和探針核苷酸序列、PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突變檢 測特異性引物和探針核苷酸序列、TRM24、TRIM33和RET-12基因融合突變檢測特異性引物 和探針核苷酸序列、KIF5B-24和RET-11基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列 及KIF5B-15和RET-11基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列；所述的KIF5B和 RET-12基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列具體為： KIF15F GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ ID NO ：05 KIF16F TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT SEQ ID NO :06 KIF22F CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC SEQ ID NO :07 KIF23F AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC SEQ ID NO :08 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO :09 Taqman Retl2 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID N0:10。
[0012] 所述的(XD1、(XD2、ERC和RET-12基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序 列具體為： CCDC1F GCACTGCAGGAGGAGAACC SEQ ID NO ：11 CCDC2F TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG SEQ ID NO: 12 ERC11F TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG SEQ ID NO: 13 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：14 Taqman Ret12 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO: 15。
[0013] 所述的G0LGA7F、NC0A8F、H00K11F和RET-12基因融合突變檢測特異性引物和探針 核苷酸序列具體為： G0LGA7F GAAGCTGATGGGCCAGATACAT SEQ ID NO ：16 NCOA8F CAGGACTGGCTTACCCAAAAG SEQ ID NO: 17 HOOK11F AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG SEQ ID NO: 18 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO: 19 Taqman Retl2 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID N0:20。
[0014] 所述的PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突變檢測特異性引物和探針 核苷酸序列具體為： PCM29F GACCGGCAAATTAAAGCAATTAT SEQ ID NO ：21 PRKAR7F AATGTGAAATTGTGGGGCATC SEQ ID NO ：22 KTN29F GCCATGCTAAAAGAGAGGGAG SEQ ID NO : 23 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：24 Taqman Retl2 FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO :25。
[0015] 所述的TRM24、TRM33和RET-12基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序 列具體為： TRIM24-9F GCACCTGTGGGTTTACCAAAC SEQ ID NO ：26 TRIM33-16F GTAAGAAGGGGAAAACTGCGC SEQ ID NO ：27 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO : 28 Taqman Retl2 FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO :29。
[0016] 所述的KIF5B-24和RET-11基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列具體 為： KIF24F TCGCATAAAGGAAGCAGTCAG SEQ ID NO ：10 K24R11R TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO: 10 TaqmanK24Rll FAM-5-AAGAGGGCATTCTGCAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO : 30。
[0017] 所述的KIF5B-15和RET-11基因融合突變檢測特異性引物和探針核苷酸序列具體 為： KIF15F GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ ID NO ：31 K15R11R CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO ：32 TaqmanK15Rll FAM-5-ATCTCCTCAGCTGAGATGAC-3-BHQ-MGB SEQ ID N0:33。
[0018] 上述的用于RET融合基因檢測的引物、探針，其中，還包括參考基因特異性引物和 探針核苷酸序列，具體為： ACTBF CTGGCATTGCCGACAGGA SEQ IDN0 ：34 ACTBR AGGAGCAATGATCTTGATCTTC SEQ IDN0 ：35 ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB SEQIDN0:36。
[0019] 一種用于RET融合基因檢測的檢測試劑盒，其中，包括mRNA反轉錄cDNA體系，所 述的mRNA反轉錄cDNA體系用于所述的檢測試劑盒的PCR反應，所述的mRNA反轉錄cDNA 體系包括： 5XRT buffer 4M-L 引物終濃度 200nM dNTP ImM superRT 200U RNA 6ML 補DEPC水至 20ML ; 所述的檢測試劑盒的PCR反應擴增體系為： 10XPCRBuffer 稀釋為IX dNTP 0. 2mM 模板 2uL 各引物 200-400 nM 各探針 100-400 nM 熱啟動Taq酶 1U MgCL2 2-5mM 總體積 20uL。
[0020] 上述的用于RET融合基因檢測的檢測試劑盒，其中，所述的mRNA反轉錄cDNA體系 包括如下操作步驟： 步驟1:取逆轉錄反應混合液13ML，superRT逆轉錄酶1M1，加入無菌離心管中，混勾。<