一種快速鑒定煙草黑脛病抗性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于作物抗病性鑒定領域，特別是一種快速鑒定煙草黑脛病抗性的方法【背景技術】
[0002] 煙草黑腔病（Phytophthoraparasiticavar.nicotianaeTucker)是危害煙草 的一種毀滅性土傳病害，其分布范圍廣、潛伏期短、發病快、發病率高，會與其他病害混合發 生。美國北卡羅萊納州每年因煙草黑脛病損失的煙葉約占總產量的1%~2% ;1955、1966 年兩年間因黑脛病造成的損失達3610萬美元，占病害損失的35. 13%，居各病害之首。我國 煙草黑脛病病害的發生始于1919~1945年，到80年代以后，煙草黑脛病在我國迅速擴展。 據調查，除黑龍江省尚未發生該病外，其余各植煙省區均有發生。尤其以山東、河南、安徽發 病較重，嚴重田塊發病率高達75%，甚至造成絕收。
[0003]據不完全統計，我國平均每年因煙草黑脛病造成的損失達到1億元以上，已嚴重 威脅部分煙區煙葉生產的發展。而目前生產的植煙品種對該病害的抗性都較差，又缺乏安 全有效的化學手段防治，一旦發病，便束手無策。因此控制該病害發生和流行的最根本的思 路是選育和利用抗病材料。
[0004] 而準確快速有效的鑒定是對煙草抗源的挖掘、利用和抗病品種選育的首要環節。
[0005] 現有的煙草黑脛病抗性鑒定方法主要有3種，一是溫室苗期鑒定接種法，二是田 間病圃鑒定，三是毒素浸種法。
[0006] 苗期鑒定法通常采用孢子懸浮液或菌絲體懸浮液浸根接種，此種方法因接種時所 用孢子分布不均會出現接種強度不一致的現象，易造成鑒定誤差；
[0007]田間病圃鑒定是目前常用的鑒定方法，是移栽緩苗后接種，其鑒定結果受地塊本 身菌落分布均勻度、環境條件等影響，往往不同年份的鑒定結果會存在一定的差異，并且田 間病圃鑒定需要時間長，占地面積大，試驗費用高；
[0008] 毒素浸種法是將煙草黑脛病菌接種于燕麥固體培養基中，培養7~14天，待菌絲 長滿整個皿后，取菌塊加入燕麥液體培養基中振蕩培養7~14天，得煙草黑脛病菌分生孢 子懸浮液，稀釋為9X105,濾紙過濾，高速離心后無菌濾膜過濾得粗度素。其缺點：第一是整 個粗度素的提取過程步驟繁瑣，時耗長，需要28天左右，且提取毒素量有限；其次病原菌毒 素產毒條件要求較為苛刻，對光照，溫度，暗處理時間，培養基等都有一定的選擇；另外毒素 處理種子或組織時毒素濃度的大小也不容易確定，需要反復試驗，才可以確定適宜的濃度 范圍，因此工作量也比較大。
【發明內容】
[0009] 針對現有煙草黑脛病抗性鑒定技術存在的不足，本發明的目的在于提供一種快速 鑒定煙草黑脛病抗性的方法，可有效地克服現有技術的缺陷；
[0010] 其解決問題的技術方案是：
[0011] 一種快速鑒定煙草黑脛病抗性的方法，包括以下步驟：
[0012] 步驟一、煙草黑脛病菌培養：
[0013]將煙草黑腔病菌（Phytophthoraparasiticavar.nicotianaeTucker) 0 號小種； 接種于燕麥培養基上在28°C條件下培養7~10天，待菌絲長滿整個皿后，用接種環除去菌 皿表面附著的菌絲，留菌皿備用，燕麥培養基的制作方法為在l〇〇〇ml無菌水中加入15~ 20g燕麥片，煮至燕麥片開花狀，定容1000ml，分裝到500ml三角瓶中，高壓121°C，滅菌 20min，無菌條件下分裝于一次性無菌培養皿中，每皿10ml;
[0014] 步驟二、取待測煙草種子表面消毒：
[0015] 取待測煙草種子置于無菌培養皿中，用75%的酒精浸泡3分鐘，再用10%的次氯 酸鈉浸泡5分鐘，隨后用無菌水反復清洗3次，減少消毒液殘留；無菌蒸餾水的制作方法取 1000ml蒸餾水分裝100ml的三角瓶中，高壓121°C，滅菌20min;
[0016] 步驟三、發芽率，發病率統計，并進行抗病性評價：
[0017] 分別將步驟二中消毒煙草種子無菌條件下轉移到步驟一培養的煙草黑脛病菌 皿和沒有接種煙草黑脛病菌的燕麥培養基（CK)上，每皿100粒，保持在相對濕度80%~ 90%、光照強度lOOOlx~20001X、溫度25~28°C，3~7天后開始觀察發芽情況，根據發 病率判斷供試材料的抗性，發病率多50%為感病品種，發病率< 50%為中抗品種， 發病率< 15 %為抗病品種。
[0018] 所用的黑脛病菌種由中國農業科學院煙草研宄所提供，其余試劑均為市售產品； 所用儀器光學顯微鏡、超凈工作臺VS-1300L-U和MGC-300H光照培養箱。
[0019] 本發明涉及的煙草黑脛病快速鑒定方法，具有以下特點，第一，直接利用種子鑒 定，可以在黑脛病菌皿中直接完成煙草種子對黑脛病的抗性鑒定，比毒素浸種鑒定法省略 了黑脛病毒素的提取和保存、毒素活性鑒定、毒素浸種適宜濃度篩選等一系列步驟；比利用 成苗或煙株鑒定試驗省略了培養煙株的繁瑣，此方法不僅節省了人力物力，還大幅度的縮 短鑒定時間，一批次完成只需7~10天即可，對于發芽勢較強的種子3~5天即可鑒定出 其對黑脛病的抗性水平；第二，使煙草對黑脛病的抗性不受生長季節限制，任何季節都能展 開鑒定工作；第三，鑒定在恒溫光照培養箱中進行，對溫濕度進行控制，發病條件不存在差 異，鑒定結果受外界影響小，結果更準確，且鑒定操作步驟簡單；第四，與毒素浸種抗性鑒定 方法相比對試驗室要求條件較低；該方法完全實現了低成本，高通量、快速鑒定煙草黑脛病 的目的，更適宜于煙草育種研宄中大批量種質材料黑脛病抗性鑒定，以加速抗病種質資源 篩選、抗性遺傳特性研宄、抗病品種的育種與推廣應用。
【具體實施方式】
[0020] 以下結合實施例對本發明的內容做進一步的解釋說明：
[0021] 實施例一
[0022] 一種快速鑒定煙草黑脛病抗性的方法，包括以下步驟：
[0023] 步驟一、煙草黑脛病菌培養：
[0024] 將煙草黑脛病菌0號小種；接種于燕麥培養基上在28°C條件下培養7~10天，待 菌絲長滿整個皿后，用接種環除去菌皿表面附著的菌絲，留菌皿備用；
[0025] 步驟二、取待測煙草種子表面消毒：