具有促進骨骼生長作用的膠原肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蛋白質生物利用加工技術領域，更具體地說是涉及一種具有促進骨骼 生長作用的膠原肽及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白質是人類重要的營養素，通過人體消化道被蛋白酶水解為肽或氨基酸，從而 被人體吸收合成新蛋白。近代的研宄表明，小肽往往比氨基酸具有更好的消化吸收特性，除 具有吸收利用率高(接近100%)、促進氨基酸吸收和蛋白質合成、提高免疫力、促進礦物質吸 收的特點外，通常還具有一定的生理活性，對人體十分有益。
[0003] 近來，隨著生物技術和酶制劑工業的不斷發展，酶法水解蛋白質以達到對蛋白質 進行改性的應用越來越普遍。利用酶水解法已可制備出多種具有生理活性的多肽和氨基 酸，這些活性肽包括抗氧化性肽、降血壓肽、抑菌肽、降膽固醇肽、嗎啡肽、免疫調節肽等；這 些肽可以被人體充分吸收，補充人體所需的營養，調節機體功能，促進身體健康；而且因為 這些肽具有優良的持水性、溶解性、滲透性及抗氧化性等特性，已被廣泛應用于食品、化妝 品和醫藥等彳丁業。
[0004] 借助于膠原基質本身的氨基酸組成特征，并利用蛋白酶的酶切位點選擇性可實現 定位水解產生特定組成和功能的活性肽。在酶法水解蛋白質的過程中蛋白酶的選擇是制備 膠原肽的第一關鍵要素，目前在實際生產中應用較多的主要包括各種微生物來源、植物來 源及動物來源的蛋白酶，其中包括堿性蛋白酶、風味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶 等；但由于不同蛋白酶的來源、作用位點及水解條件并不相同，而且，即使是用同一蛋白酶， 在采用不同的水解工藝的情形下最終的改性效果及肽生物活性往往差異極大，因此，如何 辨別、甄選得到合適的酶，并配合以適度的工藝參數，是對所使用的膠原基質原料實現所需 的改性效果并進而制備獲得具有特定生物活性的膠原肽的最大難點。
【發明內容】
[0005] 肽的生物活性通常與其原料來源、分子量大小、氨基酸序列等有關。大分子的膠原 蛋白經過酶的適度水解后可獲得不同分子量大小的膠原肽。目前研宄表明膠原蛋白水解產 物一一膠原肽具有抗氧化、降血壓等活性。而來源于膠原蛋白的肽在氨基酸組成上具有甘 氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸(或其他氨基酸）的重復單元特征，如獲得3個氨基酸殘基的膠原 小肽，不僅其在體內的消化吸收率可顯著提高，還可能具有機體功能相匹配的其它生物活 性。
[0006] 本發明通過酶條件的篩選和控制、以及活性的驗證，目的在于確定一種通過促進 成骨細胞增殖和分化從而具有促進骨骼生長作用的膠原肽及其制備方法和應用。
[0007] -、本發明的第一目的，是提供一種具有促進骨骼生長的膠原肽的制備方法的技 術方案。
[0008] 具體的技術方案為：將魚皮膠原基質經包括除雜、膠原降解、澄清、濃縮、干燥在內 的步驟，得到膠原肽產品；其中的除雜、澄清、濃縮及干燥工藝的具體參數，可由所屬領域技 術人員參照現有技術并結合物料特性自行選用。本發明人通過實驗分析、研宄發現：魚皮膠 原降解包括了膠原纖維的吸水水化、吸水膠原微纖維的熱解離、原膠原的肽鍵水解斷裂三 個過程；其中，膠原吸水水化與溶液的離子種類、濃度、強度、時間有關；膠原微纖維的熱解 離與物料在熱解離前的水化程度、溶液離子狀態、熱處理的溫度、時間有關；而原膠原的肽 鍵水解斷裂與所使用的酶的種類、活力、酶作用條件相關；只有上述三者的工藝條件與工藝 參數有機結合，才能獲得所需的膠原肽的活性。通過系列實驗及數據分析，本發明人最終確 定本發明中所述膠原降解步驟的具體工藝要求如下：在魚皮膠原基質中加入其重量4~5 倍、質量濃度為1~5g/L的酸溶液，均勻浸泡20~120分鐘；然后加熱至55~60°C并保 溫攪拌10~60分鐘；過濾除掉濾渣，在濾液中按6000~8000U/g膠原基質添加蛋白酶，并 調整pH在6. 5~7. 5范圍內、溫度50~55°C下反應7~8h;然后升溫至沸騰并保持1~ 2min，即得。
[0009] 上述膠原降解步驟中對所用酸的具體種類并無嚴格限定，所屬領域技術人員可結 合生產實際參照常規酶法水解蛋白質工藝中酸脹步驟的用酸進行自主選擇，例如采用（但 不限于）鹽酸、醋酸、乳酸、或磷酸等；所述蛋白酶，可以選用動物蛋白酶、風味酶、堿性蛋白 酶、木瓜蛋白酶等商品酶制劑，優選采用包含有動物蛋白酶和風味酶的復合酶，并且二者按 質量比1:1復合使用。
[0010] 以下，給出所述澄清步驟的其中一種優選實施工藝：將所述膠原降解步驟制得的 酶解液趁熱進行粗濾(例如用濾布)，再按每升濾液0. 5~5. 0g的添加量往該濾液中加入活性 炭，然后于40~50°C保溫20~25min，最后經板框過濾獲得清液。
[0011] 本發明采用的膠原基質源于魚類皮組織，其獲取及制備方法均有成熟工藝可循， 例如可以將魚類皮組織原料經簡單預處理(如清洗、粉碎等）后直接使用。如果采用其他來 源的膠原基質材料，由于動物來源不同、組織部位及特性不同，處理條件和最佳參數會具有 較大的差異性。采用水產動物魚類的皮組織作為膠原基質原料制備膠原肽，除了資源易得 且豐富、無哺乳動物疫病困擾、生物安全性高等特點，經本發明人的研宄發現還具有膠原基 質降解敏感度高、膠原肽的轉化效率高、制備得到的膠原小肽具有明確活性等優點。本發明 技術方案顯然有助于大大提升魚類加工下腳料魚皮的附加值。
[0012] 二、本發明的第二目的，是提供一種具有促進骨骼生長作用的膠原肽。
[0013] 本發明具有促進骨骼生長作用的膠原肽即是采用上述的膠原肽制備方法制備而 得的產品。所制得的產品色澤均勻、粉末細膩，溶解性好，無腥味和異味。
[0014] 進一步的測試表明，采用上述的膠原肽制備方法制備而得的本發明膠原肽產品中 分子量大于lOOODa的膠原肽組分所占的質量百分比不超過5%，分子量小于lOOODa的膠原 肽組分所占的質量比超過95%，其中分子量在1000~500Da、500~180Da及180Da以下的 膠原肽組分所占的質量百分比分別為12~16%、45~48%、33~35% ;同時，膠原肽產品中甘氨酸 占產品總氨基酸的摩爾比為30~33%。
[0015] 經細胞實驗證實，本發明膠原肽產品具有明確的促進成骨細胞增殖活性，且分子 量小（80%的產品分子量小于500Da，氨基酸聚合度以3~5氨基酸殘基為主)，蛋白純度高。
[0016] 三、本發明的第三目的，是進一步公開采用上述方法制備得到的膠原肽作為食品 輔料的應用以及在制備保健食品方面的應用。
[0017] 以下以實驗數據及實施例相結合的方式對本發明具有促進骨骼生長作用的膠原 肽及其制備方法和應用作進一步地說明。由于這些實驗數據及實施例是作為介紹本發明技 術方案而例舉的一些較佳實施方式，因此，不應把本發明的技術方案限定于這些實施例范 圍之內。
【附圖說明】
[0018] 圖1是不同酶解時間膠原肽對成骨細胞增殖的影