在昆蟲細胞sf9中表達hABCB11的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種在昆蟲細胞sf9中表達hABCBll的方法，屬于生物基因工程領域。
【背景技術】
[0002]ABCBll是ABC七大家族轉運體中G族的蛋白成員之一，在人的正常細胞和腫瘤組織中均有表達，如小腸上皮頂膜、胎盤合胞體滋養層、腸小管膜、大腦微血管皮細胞、乳腺小葉、和乳腺癌細胞等。ABC蛋白的主要功能是小分子物質及多肽分子跨膜轉運。轉運膜區會通過改變形態允許某些分子通過。免疫組化顯示ABCBlI主要在細胞膜和胞漿中表達，不僅具有吸收、分泌和排泄功能，而且具有抑制消化道吸收某些外源性物質，參與形成血腦、胎血屏障等生理功能；同時ABCBll是ATP結合轉運蛋白，需要結合水解胞漿中的ATP，以此確保轉運底物所需的足夠能量，該蛋白及轉運膜區的這些特殊反應能夠使轉運子與底物像齒輪一樣吻合并通過水解ATP來轉運底物。此外，ABCBll也是與腫瘤多藥耐藥有關的新的藥物排出泵，是腫瘤多藥耐藥的重要機制之一。因此，對ABCBll的抑制劑或底物的研究具有重要意義。目前尚未有在昆蟲細胞中表達hABCBll的相關方法報道。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提出一種在昆蟲細胞sf9中表達hABCBll的方法，通過該方法制得的hABCBll可用于hABCBll底物或抑制劑的檢測。本發明的目的將通過以下技術方案得以實現:
一種在昆蟲細胞sf9中表達人hABCBll的方法，包括如下步驟:
步驟一，人工合成兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的hABCBll基因；
步驟二，將hABCBll基因克隆入pFastBacl載體的BamHI/Hindlll位點，得到重組質粒pFastBac1-hABCB11 ；
步驟三，將重組質粒pFastBacl-hABCBll轉化DHlOBac大腸桿菌感受態細胞，與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組，獲得插入hABCBll基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll ；
步驟四，脂質體介導重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll轉染sf9昆蟲細胞，獲高滴度的hABCBll的重組病毒；
步驟五，hABCBll的重組病毒感染SF9昆蟲細胞，大量表達hABCBll蛋白。
[0004]本發明進一步地，步驟一所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的人hABCBll基因通過如下方法獲得:根據NCBI參考序列信息NM_003742.2，在5‘端添加BamHI酶切位點序列，在3’端添加HindIII酶切位點序列，序列總長度為4189bp。
[0005]本發明進一步地，還包含對所述重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll的PCR鑒定方法，步驟如下:分別以 T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T-pFast R: (SEQ ID N0.2)、T-hABCBll F: (SEQ ID N0.3)和 T-hABCBll R: (SEQ ID N0.4)、或 \ 和 T-pFast F: (SEQ IDN0.1 )和 T-hABCBll R: (SEQ ID N0.4)為引物組合對 SF9_hABCBll 基因組 DNA 進行 PCR擴增，擴增出對應的4505bp、653bp、1641bp目標片段，即為hABCBll基因在SF9昆蟲細胞中表達完成。
[0006]本發明進一步地，還包括重組hABCBll蛋白功能的鑒定方法，步驟如下JfABCBll蛋白的轉運底物加入表達ABCBll蛋白的細胞膜中，參與ATP/AMP反應，反應終止后將細胞膜中微囊泡外的轉運底物洗去，通過液質聯用、熒光測定法或同位素標記底物法中的一種來測定微囊泡內的轉運底物濃度，從而判定ABCBll蛋白的活性。
[0007]本發明進一步地，所述微囊泡內的轉運底物濃度越大，ABCBll的活性越高。
[0008]本發明進一步地，所述的重組病毒培養基為無血清無抗生素的昆蟲細胞培養基。
[0009]本發明的應用和實施使其顯著技術效果為:
①參照序列合成了hABCBll基因，進而將其克隆入pFastBacl載體，并進一步獲得含hABCBll基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll，通過脂質體介導轉染sf9昆蟲細胞，成功實現了 hABCBll基因在昆蟲細胞中的表達，為hABCBll的大量獲得提供一條新途徑，為人ABCBll蛋白的應用開發打下工作基礎；
②通過本發明方法可獲得高滴度的重組的桿狀病毒，進而直接感染昆蟲細胞，有利于大規模生產其外源蛋白；
③利用本發明方法制得的重組人hABCBll蛋白制作成藥物體外測試試劑盒，可實現hABCBll蛋白底物或抑制劑藥物體外吸收測試的全自動高通量篩選，與現有體外細胞ABCBll模型測試方法相比，靈活性更高、重復性更好。
[0010]以下便結合實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步的詳述，以使本發明技術方案更易于理解、掌握。
【具體實施方式】
[0011 ] 下面通過具體實施例對本發明的方法進行說明，但本發明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0012]一種在昆蟲細胞sf9中表達人hABCBll的方法，包括如下步驟:
步驟一，人工合成兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的hABCBll基因。
[0013]步驟二，將hABCBll基因克隆入pFastBacl載體的BamHI/Hindlll位點，得到重組質粒pFastBacl-hABCBll ;所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的人hABCBll基因通過如下方法獲得:根據NCBI參考序列信息NM_003742.2，在5 ‘端添加BamHI酶切位點序列，在3’端添加HindIII酶切位點序列，序列總長度為4189bp，可將該序列信息發送至基因合成公司進行人工合成基因。
[0014]步驟三，將重組質粒pFastBacl-hABCBll轉化DHlOBac大腸桿菌感受態細胞，與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組，獲得插入hABCBll基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll ;該重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll的鑒定方法包括但不限于PCR鑒定，具體步驟詳述如下:
分別以 T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T-pFast R: (SEQ ID N0.2)、T_hABCBll F: (SEQID N0.3)和T-hABCBll R: (SEQ ID N0.4),T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和T-hABCBll R: (SEQID N0.4)為引物組合對SF9-hABCBll基因組DNA進行PCR擴增，擴增出對應的4505bp、653bp、1641bp目標片段，即為hABCBll基因在SF9昆蟲細胞中表達完成。
[0015]所述的重組病毒培養基為無血清無抗生素的昆蟲細胞培養基。
[0016]步驟四，脂質體介導重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll轉染sf9昆蟲細胞，獲高滴度的hABCBll的重組病毒；
步驟五，hABCBll的重組病毒感染SF9昆蟲細胞，大量表達hABCBll蛋白。
[0017]本發明具體實施例的，還包括重組hABCBll蛋白功能的鑒定方法，步驟如下:將ABCBll蛋白的轉運底物加入表達ABCBll蛋白的細胞膜中，加入ATP/AMP反應，反應終止后將細胞膜中微囊泡外面的轉運底物洗去，細胞微囊泡是各類細胞遭受一系列應激(激活或凋亡)時，從細胞質膜上脫落而釋放的膜性小囊泡，可通過液質聯用、熒光測定法或同位素標記底物法中的一種來測定微囊泡內的轉運底物濃度，從而判定ABCBl I蛋白的活性，所述微囊泡內的轉運底物濃度越大，ABCBll的活性越高。
[0018]本發明方法參照序列合成了 hABCBll基因，進而將其克隆入pFastBacl載體，并進一步獲得含hABCBll基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBll，通過脂質體介導轉染sf9昆蟲細胞，成功實現了 hABCBll基因在昆