一種雌雄同體蝦的性別誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物性別調(diào)控技術(shù)，具體涉及一種蝦類(lèi)的性別誘導(dǎo)技術(shù)，特 別是涉及一種兼有雌性生殖系統(tǒng)和雄性生殖系統(tǒng)的雌雄同體羅氏沼蝦的誘導(dǎo)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 雌雄同體是指在一個(gè)動(dòng)物體中雌性性狀和雄性性狀都明顯的現(xiàn)象，而雌雄異體是 指同種動(dòng)物雌雄生殖器官分別生在不同個(gè)體內(nèi)的現(xiàn)象。自然界中的雌雄同體現(xiàn)象多出現(xiàn)于 低等動(dòng)物。羅氏沼奸（Macrobrachiumrosenbergii)是一種大型淡水奸，它具有生長(zhǎng)快、食 性廣、肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成份好以及養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn)。自然界中的羅氏沼蝦為雌雄異體生物，其雌 性和雄性生殖器官分別存在雌蝦和雄蝦個(gè)體中。雄性羅氏沼蝦的頭胸甲內(nèi)存在雄性生殖系 統(tǒng)，包括精巢、輸精管和壺腹三部分，同時(shí)在第五步足基部存在一對(duì)雄性生殖孔。雌性羅氏 沼蝦的頭胸甲內(nèi)存在雌性生殖系統(tǒng)，包括卵巢和輸卵管兩部分，同時(shí)在第三步足基部存在 一對(duì)雌性生殖孔。羅氏沼蝦的生長(zhǎng)過(guò)程中存在雌雄兩態(tài)性，若利用好這種性別特征優(yōu)勢(shì)，將 能大大提高水產(chǎn)養(yǎng)殖效益。但目前，蝦蟹動(dòng)物性別決定和性別分化、生殖和受精的分子機(jī)制 知之甚少。
[0003] 促雄性腺是甲殼動(dòng)物特有的一種內(nèi)分泌腺，其分泌的促雄性腺激素具有調(diào)控性別 分化和維持雄性第二性征的功能。蝦類(lèi)動(dòng)物的性別調(diào)控研宄主要集中在促雄性腺體的應(yīng)用 開(kāi)發(fā)。一方面，可以通過(guò)移除促雄性腺使雄性個(gè)體的性別逆轉(zhuǎn)。但是，促雄性腺體積微小， 不易移除完全，性別逆轉(zhuǎn)比例不高，成功率較低。另一方面，采用移植促雄性腺或注射促雄 性腺體提取物的方法，研宄促雄性腺在調(diào)控性別調(diào)控方面的生理功能。但是，促雄性腺體樣 本獲取不易，微量的提取物不易開(kāi)展大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。
[0004]目前，從羅氏沼蝦促雄性腺的CDNA消減文庫(kù)，已篩選獲得兩個(gè)促雄性腺體中特異 表達(dá)的基因，推測(cè)其可能與羅氏沼蝦的性別調(diào)控有關(guān)?，F(xiàn)階段，正解析促雄性腺體特異基因 分子結(jié)構(gòu)，并利用分子生物技術(shù)和手段，進(jìn)一步開(kāi)展促雄性腺特異基因在沼蝦性別調(diào)控方 面的機(jī)理研宄。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種羅氏沼蝦的性別誘導(dǎo)技術(shù)，針對(duì) 促雄性腺特異表達(dá)的基因，利用RNA干擾技術(shù)，使沼蝦體內(nèi)目的基因沉默，實(shí)現(xiàn)對(duì)羅氏沼蝦 的性別誘導(dǎo)。通過(guò)本發(fā)明的誘導(dǎo)技術(shù)，促使沼蝦個(gè)體發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)，形成雌雄同體的羅氏沼 蝦，其體內(nèi)兼有雌性生殖系統(tǒng)和雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育，建立一套有效的羅氏沼蝦性別誘導(dǎo) 技術(shù)。同時(shí)，利用本發(fā)明培育獲得的雌雄同體蝦可以為蝦蟹動(dòng)物的性別決定和性別分化、生 殖和受精研宄提供良好的科研材料和動(dòng)物樣本。
[0006] 本發(fā)明的方法，包括如下的步驟：
[0007]1)雙鏈RNA樣品制備
[0008] 首先，抽提羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)壺腹組織RNA樣品，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;以cDNA 序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆獲得促雄性腺體特異的目的基因片段；然后，利用雙鏈RNA表達(dá)載體，合成和制備雙鏈RNA樣品；
[0009] 其中目的基因的核苷酸包含有：
[0010] 1)序列為SEQIDNO: 1的核苷酸，
[0011] 2)與1)中的核酸分子具有85%以上同源性，且具有1)中核酸分子作用的核酸。
[0012] 上述2)中的同源性，優(yōu)選為90%以上；
[0013] 上述步驟1)PCR擴(kuò)增的引物序列為SEQIDN0:2和SEQIDN0:3;
[0014]2)RNA干擾
[0015] 利用顯微注射、投喂或浸泡等多種方式，將目的雙鏈RNA樣品送入沼蝦體內(nèi)；選取 雄性幼苗或幼蝦（性別分化期的沼蝦）進(jìn)行RNA干擾，將步驟1)制備的雙鏈RNA樣品送入 沼蝦體內(nèi)進(jìn)行RNA干擾，使目的基因的核酸水平降低80%以上，實(shí)現(xiàn)目的基因的高效沉默， 從而誘導(dǎo)雄性羅氏沼蝦在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)，形成羅氏沼蝦的雌雄同體蝦，其體內(nèi) 兼有雌性生殖系統(tǒng)和雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育。
[0016] 雌雄同體蝦的特征檢查：
[0017] 外觀形態(tài)：所述的雌雄同體羅氏沼蝦在外觀形態(tài)上同時(shí)體現(xiàn)出雌性和雄性的外觀 性別特征，在其頭胸甲腹面的第五步足基部存在一對(duì)雄性生殖孔，同時(shí)在第三步足基部存 在雌性生殖孔，即同一個(gè)體上兼有雌性生殖孔和雄性生殖孔。
[0018] 生殖系統(tǒng)的組成：雌雄同體蝦的生殖系統(tǒng)同時(shí)兼有雌性和雄性生殖的系統(tǒng)組成和 發(fā)育特征。雄性羅氏沼蝦個(gè)體的頭胸部存在雄性生殖系統(tǒng)，包括精巢、輸精管和壺腹三部 分。雌性羅氏沼蝦個(gè)體的頭胸部存在雌性生殖系統(tǒng)，包括卵巢和輸卵管兩部分。雌雄同體 蝦兼有雌性和雄性生殖系統(tǒng)存在和發(fā)育，且雌性生殖系統(tǒng)中卵巢組織和雄性生殖系統(tǒng)中的 精巢組織都有良好發(fā)育。
[0019] 精巢和卵巢的發(fā)育：根據(jù)不同發(fā)育階段，卵巢組織外觀可呈現(xiàn)出乳白色、淡黃色、 黃色等，卵巢中具有卵黃蛋白（原）的形成和積累。利用石蠟切片技術(shù)，結(jié)合蘇木素和伊紅 染色方法，可以在顯微鏡下清晰看到羅氏沼蝦卵巢中存在不同發(fā)育階段的卵細(xì)胞和卵黃顆 粒。另外，精巢和輸精管組織外觀呈現(xiàn)乳白色，結(jié)構(gòu)完整，發(fā)育良好。顯微鏡下觀察到精巢 中存在多個(gè)精囊小泡和發(fā)育成熟的大量傘狀精子細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明方法攻克目前水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域蝦類(lèi)性別誘導(dǎo)和調(diào)控研宄中遇到的技術(shù)難題， 通過(guò)RNA干擾技術(shù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，進(jìn)行定向性別控制，誘導(dǎo)雄蝦個(gè)體性別逆轉(zhuǎn)， 形成雌雄同體蝦。本發(fā)明不僅提供一種蝦類(lèi)性別誘導(dǎo)技術(shù)，也為蝦蟹動(dòng)物的性別決定和性 別分化、生殖和受精研宄提供良好的科研材料和動(dòng)物樣本。本發(fā)明操作方法具有原創(chuàng)性，實(shí) 施步驟清晰。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1:性別基因的雙鏈RNA樣品制備；
[0022] 圖2 :性別基因的RNA干擾效率測(cè)定；
[0023] 圖3:羅氏沼蝦雌雄同體蝦的外觀形態(tài)和生殖孔分布；
[0024] 圖4:羅氏沼蝦雌雄同體蝦的生殖系統(tǒng)解剖圖；
[0025] 圖5:性別基因的雙鏈RNA樣品制備圖；
[0026] 圖6:性別基因的RNA干擾效率測(cè)定圖。
【具體實(shí)施方式】 [0027] 1
[0028] 本發(fā)明通過(guò)從羅氏沼蝦促雄性腺cDNA消減文庫(kù)中篩選獲得兩個(gè)性別特異表達(dá)的 基因進(jìn)行RNA干擾技術(shù)和羅氏沼蝦動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在沼蝦體內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的基因的高效沉默，成功 開(kāi)展雌雄同體蝦性別誘導(dǎo)。
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 步驟（1)雙鏈RNA樣品制備
[0032] 根據(jù)篩選的性別基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的正向引物和反向引物， RNAi-PF:5'-GCTCTAGAGTGTGTGTTGTTCTGCTCACTCGT-3')(下劃線處為Xbal酶切位點(diǎn)SEQ ID N0:2)和RNAi-PR(SEQ ID N0:3:5'-CGAGCTCGCAGCATTCCTCCCTTGGACTTCT-3r )(下劃 線處為SacI酶切位點(diǎn)），用于PCR反應(yīng)擴(kuò)增，獲得目的基因序列如下所述：
[0033] Gtgtgtgttgttctgctcactcgtagcatcgcttctccctcaaccttcttcgagctatgagatcgaatg cctctccgttgactttgactgcggcgacataacgaacacccttgcctccgtctgcctgagacacaacaactacatca acccaggacccacctacgtttccaaagagcgacgatctgctgacatctataccgttccttctacgaagtctccatcg ctcgcccacccgagagctacccacttgaccatggctgacgaagaaactcagaaggtatctaaggtggaggaggagat tcagcacatgacgctgagcagggaagaagcgaacaatatgctgcattcgaagcgtcgcttccggagggacagcgtga ggagaagtccaagggaggaatgctgc(SEQ ID NO:1)
[0034] 利用雙鏈RNA表達(dá)載體，合成和制備雙鏈RNA樣品，純化得到的雙鏈RNA經(jīng)電泳檢 測(cè)并定量分析后保存待用。（圖1)
[0035]步驟（2).RNA干擾
[0036]從羅氏沼蝦育種養(yǎng)殖基地選取體質(zhì)健壯、附肢完整的雄性幼苗（潘狀幼體期）或 幼蝦（性別分化時(shí)期）進(jìn)行RNA干擾。本實(shí)施例中，利用顯微注射的方法，經(jīng)頭胸甲與腹部 交界處，第五步足基部腹膜下注射5-10yg雙鏈RNA/只，放回水泥池中繼續(xù)飼養(yǎng)。每隔一 個(gè)月再次注射同樣的雙鏈RNA樣品至同組蝦體內(nèi)，維持RNAi的有效性，注射周期為3個(gè)月 (圖2RNA干擾效率檢測(cè)）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可以利用多種方式（顯微注射、投喂或浸泡） 將性別基因的RNA干擾樣品送至沼蝦體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)目的基因沉默，圖2結(jié)果表明對(duì)性別基因的 RNA干擾效率很高，滿足干擾的要求。
[0037] 步驟（3).雌雄同體蝦的特征
[0038] 性別基因RNA干擾后的羅氏沼蝦于室內(nèi)或室外水域中飼養(yǎng)，體長(zhǎng)至3-5cm，第二性 別特征分化完成后，抓捕并鑒定雌雄同體的羅氏沼蝦。自然界中的羅氏沼蝦為雌雄異體的 生物，外觀表現(xiàn)為雌蝦在其頭胸甲的第三步足基部存在一對(duì)雌性生殖孔，而雄蝦在