一種利用抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)化培育耐寒玉米的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物的培育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)化培 育耐寒玉米的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然環(huán)境下，低溫寒害不僅影響植物生長(zhǎng)發(fā)育也影響其地理分布；對(duì)于農(nóng)作物而 言，低溫寒害可能會(huì)使其減產(chǎn)和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收，是農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程不可避 免的非生物脅迫因素。我國(guó)東北部發(fā)生的早霜凍嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量、云貴川頻繁發(fā)生的 秋寒及倒春寒顯著延緩玉米的生長(zhǎng)發(fā)育從而造成減產(chǎn)。尤其是春播玉米，氣溫降至8°c連續(xù) 3-4天即可造成爛種和死苗，持續(xù)5-6天死苗率超過(guò)30-40%，持續(xù)一周死苗率超過(guò)60%。
[0003] 因此提高農(nóng)作物的耐寒能力對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是十分必要的。通過(guò)品種改良提高農(nóng)作 物的耐寒能力，是克服低溫寒害最為經(jīng)濟(jì)有效地方法。然而，植物抗凍性屬于多基因控制的 性狀，其理化機(jī)制及遺傳機(jī)理復(fù)雜，利用常規(guī)育種手段往往難以達(dá)到定向改良的目的。應(yīng)用 分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行植物抗凍耐寒性的遺傳改良逐漸成為了研宄熱點(diǎn)并取得了一些成功。 因此，利用抗寒能力強(qiáng)、適宜農(nóng)作物生理代謝機(jī)制與生產(chǎn)要求的抗寒基因來(lái)培育耐寒農(nóng)作 物品種具有重要的研宄意義。
[0004] 20世紀(jì)60年代，科學(xué)家在生活在極區(qū)海域的魚類血液中發(fā)現(xiàn)大分子物質(zhì)，經(jīng)研宄 命名為抗凍蛋白。此類物質(zhì)在魚類體內(nèi)使得體液的冰點(diǎn)降到海水溫度以下，保證血液不結(jié) 冰凝固。后來(lái)深入的研宄使得人們從極區(qū)魚類、昆蟲轉(zhuǎn)到植物材料方向，全面的了解抗凍蛋 白的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)理等方面。1991年，Hightower等人將抗凍蛋白基因afa3及融合 基因spa-afa5轉(zhuǎn)入了煙草和番茄并成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草和番茄，證明其編碼的抗凍蛋白 有助于提高植物抵御低溫寒害的能力。1999年，Michae等人從桃樹中分離定位得到了具 有修飾冰晶能力抗凍蛋白，這也是首次發(fā)現(xiàn)的具有脫水素蛋白特性的抗凍蛋白。2000年， Sidebottom等在越冬植物黑麥草（Loliumperenne)中發(fā)現(xiàn)了熱穩(wěn)定性的抗凍蛋白AFP， 其抗凍效果不如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的魚類和昆蟲類，但抑制冰晶重結(jié)晶的效果非常明顯，因此有效 地保護(hù)植株組織免受冰凍傷害。2002年，Huang等人從冬季歐白英中克隆得到了熱滯蛋白 STHP-64的全長(zhǎng)。研宄發(fā)現(xiàn)熱滯蛋白STHP-64的熱滯活性很低，但加入檸檬酸后其熱滯活 性明顯提高，抗凍能力增強(qiáng)。2014年，Kumar等人將胡蘿卜編碼抗凍蛋白的基因用CaMV35S 啟動(dòng)子（cauliflowermosaicvirus35Spromoter)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番前，成功獲 得在4°C能保持完整表型的抗凍轉(zhuǎn)基因番茄。
[0005] 本發(fā)明從矮沙冬青中克隆得到高活性抗凍蛋白基因AnAFP，構(gòu)建植物表達(dá)載體 pTU-AnAFP，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、分化獲得再生轉(zhuǎn)基因植 株，進(jìn)行PCR檢測(cè)及耐寒性鑒定，最終獲得了耐寒性性顯著提高的轉(zhuǎn)基因玉米。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的主要目的在于針對(duì)玉米耐寒性的研宄現(xiàn)狀，提供一種利用抗凍蛋白基 因轉(zhuǎn)化培育耐寒玉米的新方法。
[0007] 本發(fā)明具體通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種利用抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)化培育耐寒玉米的方法，包括以下步驟：
[0009] 1)以抗凍蛋白基因AnAFP為模板，在引物AF和AR為引物前面加上Bam HI和Sma I的酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0010] 2)在30°C溫育6~8小時(shí)條件下，將PCR產(chǎn)物與植物表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切， 并回收和純化；
[0011] 3)將雙酶切回收純化得到的目的片段和載體產(chǎn)物使用T4連接酶進(jìn)行連接，置于 16°C水浴鍋中連接過(guò)夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTU-AnAFP;
[0012] 4)植物表達(dá)載體pTU-AnAFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并接種培養(yǎng)，待其0D為0. 5時(shí)，并侵染玉 米自交系的愈傷組織；
[0013] 5)將侵染的玉米自交系的愈傷組織接種至共培培養(yǎng)基，22°C暗培養(yǎng)3d;
[0014] 6)共培養(yǎng)的愈傷組織接種至恢復(fù)培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)7d;
[0015] 7)恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含1. 5mg/L除草劑草丁膦的篩選培養(yǎng)基上，20d 后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的選擇培養(yǎng)基上，連續(xù)篩選3代，除草劑濃度按1. 5mg/L、 2. 5mg/L、3. 5mg/L遞增；
[0016] 8)選取抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上分化幼苗，將分化出的幼苗轉(zhuǎn)接到生 根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到L轉(zhuǎn)基因再生植株。
[0017] 利用矮沙冬青抗凍蛋白基因AnAFP，以AF和AR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建植物 表達(dá)載體pTU-AnAFP，將植物表達(dá)載體pTU-AnAFP利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米自交系 18-599紅的胚性愈傷組織，通過(guò)除草劑篩選、分化、生根壯苗培養(yǎng)，即可獲得再生轉(zhuǎn)基因植 株。
[0018] 本發(fā)明所述的上游引物AF為W -ATGGCAGGTATCATCAACAAGAIT-3\T游引物AR 為A'-CTAGTCACTGTCACTGCTGCTGCT-3'。
[0019] 步驟（1)中PCR擴(kuò)增體系為每20yL中含有：10XPCR緩沖液2. 0yL，DNA1yL， dNTPs1.6yL，上游引物AF4yL，下游引物AR4yL，TaqDNA聚合酶2yL，ddH20加至終體 積 20yL;PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?94°C3min;再 94°C10s，58°C30s，72°C50s，循環(huán) 34 次；72°C 延伸8min，12°C保存。
[0020] 步驟⑵中PCR產(chǎn)物酶切體系為：10 XT緩沖液1 yL，BSA 2 yL，PCR產(chǎn)物彡1 yg， BamHI1 yL，SmaI1 yL，ddH20加至終體積20 yL;植物表達(dá)載體酶切體系為：10 XT 緩沖液1UL，BSA 2yL，表達(dá)載體彡1yg，BamHI1yL，SmaI1yL，ddH20加至終體積 20 yL〇
[0021] 步驟（3)中T4連接酶反應(yīng)體系如下：10XT4DNAligaseBuffer2. 5yL，目的片 段DNA0.3pmol，pTF101.1-Ubi-T-nos0.03pmol，T4DNAligaselyL，ddH20 加至 25yL〇
[0022] 步驟（4)具體為將含有目的基因的植物載體pTU-AnAFP的農(nóng)桿菌接種到含50mg/ L利福平和50mg/L壯觀霉素的YEP培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)2天，挑取單個(gè)菌落于含相應(yīng)抗 生素的lmLYEP培養(yǎng)基中，28°C、180r/min振蕩培養(yǎng)12h，再將其加入含相應(yīng)抗生素的50mL YEP培養(yǎng)基（牛肉膏5g/L+蛋白胨5g/L+酵母提取物10g/L+蔗糖5g/L+MgS04. 7H20 0? 5g/ L，pH7. 2)擴(kuò)大培養(yǎng)至006(|(|為0. 5 ;4°C、4000r/min離心lOmin收集菌體，用等體積的液體 浸染液（N6+2, 4-D1. 5mg/L+L-脯氨酸0? 69g/L+鹿糖68. 4g/L+葡萄糖36g/L)懸浮；將待轉(zhuǎn) 化優(yōu)良玉米自交系的愈傷組織浸入含乙酰丁香酮（AS)的浸染培養(yǎng)液，黑暗浸染lOmin。
[0023] 步驟（5)所述的共培培養(yǎng)基為：N6基本培養(yǎng)基+L-脯氨酸0. 69g/L+乙酰丁香酮 20mg/L+ 硝酸銀 0? 85mg/L+L_ 半胱氨酸 300mg/L。
[0024] 步驟（6)所述的恢復(fù)培養(yǎng)基為：繼代培養(yǎng)基+MES0. 5g/L+噻孢霉素250mg/L+硝 酸銀 0? 85mg/L。
[0025] 步驟（7)所述的篩選培養(yǎng)基為：繼代培養(yǎng)基+MES0. 5g/L+噻孢霉素250mg/L+硝 酸銀0? 85mg/L+除草劑。
[0026] 步驟（8)所述的分化培養(yǎng)基為：MS+KTlmg/L+肌醇120mg/L+水解酪蛋白lOOmg/ L+L-脯氨酸690mg/L+噻孢霉素250mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5~6g/L;所述的生根壯苗培 養(yǎng)基為1/2MS+ABTlmg/L+水解酪蛋白30mg/L+肌醇50mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂5~6g/L。
[0027] 經(jīng)過(guò)自交繁育、分子檢測(cè)等研宄，表明該株系是含有矮沙冬青抗凍基因AnAFP的 轉(zhuǎn)基因植株。
[0028] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明方法利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法技術(shù)，可培育出具有優(yōu)良耐 寒玉米轉(zhuǎn)基因植株，從根本上解決玉米寒害問(wèn)題，顯著提高玉米產(chǎn)量，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是PCR擴(kuò)增目的基因電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
[0030] 圖2是重組表達(dá)載體pTU-AnAFP雙酶切驗(yàn)證電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
[0031] 圖3是植物表達(dá)載體pTU-AnAFP;
[0032] 圖4是I；再生植株目的基因PCR檢測(cè)電泳結(jié)果圖；
[0033] 圖5是1\代植株目的基因PCR檢測(cè)電泳結(jié)果圖；
[0034] 圖6是1\代陽(yáng)性植株低溫脅迫后表型鑒定圖；
[0035] 圖7是AnAFP目的基因熔解曲線分析圖；
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