一種新型低溫蛋白酶編碼基因及其在大腸桿菌中的功能表達(dá)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的克隆與表達(dá)領(lǐng)域，尤其是一種新型低溫蛋白酶編碼基因及其在 大腸桿菌中的功能表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶是水解蛋白質(zhì)的一大類酶的通稱，廣泛存在于動(dòng)物、植物和各種微生物 中，自上世紀(jì)以來在食品、洗滌、皮革、飼料、造紙、制藥等行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，占世 界用酶市場60%以上的份額。目前所用蛋白酶一般都是中高溫蛋白酶，最適酶活溫度一 般都在50°C左右，產(chǎn)酶菌的最適生長與產(chǎn)酶溫度在30°C以上。而低溫蛋白酶則是指：最 適酶活溫度在40°C以下，并且在20~30°C之間仍能保持較高催化活性的一類蛋白水解 酶。該類蛋白酶一般具有如下幾個(gè)特點(diǎn)：（1)酶的生產(chǎn)溫度低，低溫蛋白酶一般由嗜低溫菌 (psychrophiles)和耐低溫菌（psychrotrophiles)產(chǎn)生，這些低溫菌的最適生長與產(chǎn)酶溫 度一般均在20°C以下。（2)低溫蛋白酶的最適酶活溫度低，目前從低溫菌中分離到的蛋白 酶的最適催化溫度最低的為25°C，但大部分的最適催化溫度都在30°C到40°C之間，一般比 中溫蛋白酶的最適酶活溫度要低10到20°C。（3)低溫蛋白酶的熱穩(wěn)定性差，目前發(fā)現(xiàn)幾乎 所有的低溫蛋白酶都對熱敏感，這主要是由于酶分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的。與中溫酶相比， 低溫酶的共同特征是，鹽橋的數(shù)量減少，疏水核內(nèi)芳香環(huán)的相互作用減弱，脯氨酸與精氨 酸殘基數(shù)量減少，酶的疏水性減弱，使酶與溶劑的相互作用增強(qiáng)。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)都有利于 酶分子柔順性的增加以及低溫條件下的催化活性，但同時(shí)也降低了酶分子的熱穩(wěn)定性。（4) 低溫蛋白酶的活化能低，Margesin報(bào)道，從冰川分離到的三株低溫菌所產(chǎn)蛋白酶的活化能 為36. 9-38.OkJ/mol，而中溫蛋白酶的活化能一般在60kJ/mol左右。
[0003] 由于低溫蛋白酶的最適催化溫度及產(chǎn)酶溫度均接近自然環(huán)境中的溫度，因此在應(yīng) 用過程中可省去加熱和冷卻過程，與中高溫蛋白酶相比具有節(jié)能、省時(shí)等特點(diǎn)，具有中高溫 蛋白酶無法取代的優(yōu)越性。自上世紀(jì)70年代以來，世界上已有許多實(shí)驗(yàn)室在從事低溫蛋白 酶的研宄。目前低溫蛋白酶的研宄方法概括起來主要有兩種：（1)低溫選育，低溫選育是最 早采用的方法，也是最常用的方法。即從低溫環(huán)境中采集的樣品在低溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)、 分離和篩選，得到低溫下產(chǎn)蛋白酶的菌株；然后通過進(jìn)一步篩選、比較所產(chǎn)蛋白酶在不同溫 度下的酶活，以及酶的熱穩(wěn)定性，活化能等性質(zhì)，從而篩選到產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株。這是 一種從自然界中獲得低溫蛋白酶的最有效的方法。利用這種方法已從冰川、南極，深海動(dòng) 物的消化道等樣品中篩選到許多低溫蛋白酶菌株。（2)突變選育；既在原有中高溫蛋白酶 分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之上，通過定點(diǎn)突變技術(shù)、DNAShuffling以及易錯(cuò)PCR等酶分子定向進(jìn)化技 術(shù)改變原有酶分子的結(jié)構(gòu)及催化特性，提高其在低溫條件下的催化性能。目前采用該技術(shù) 已成功對中溫枯草芽孢桿菌素基因進(jìn)行了改造。所產(chǎn)的低溫枯草芽孢桿菌素在l〇°C下酶活 提高100%。但目前采用該方法獲得低溫蛋白酶的例子尚不多見。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型低溫蛋白酶編碼基因及其在大腸桿菌中的功 能表達(dá)，本申請人從南印度洋深海沉積物中分離純化獲得了一株產(chǎn)蛋白酶的嗜低溫菌 Planococcussp. 11813,保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 8088,從中獲得了一段編碼新型低溫蛋白 酶的基因cpls8,新型低溫蛋白酶編碼基因，該基因所編碼的蛋白序列共含有329個(gè)氨基酸 殘基，屬S8家族絲氨酸蛋白酶，與目前數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表蛋白序列的最高源性僅為77%，并 在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了功能表達(dá)，獲得一株高產(chǎn)低溫蛋白酶的基因工程菌。
[0005] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：
[0006] 一種新型低溫蛋白酶編碼基因，所述基因序列見序列1。
[0007] -種新型低溫蛋白酶，由上述基因編碼，其氨基酸序列見序列2。
[0008] 一種產(chǎn)新型低溫蛋白酶的基因工程菌，包括上述的基因。
[0009] 而且，所述工程菌的宿主菌為E.coliRosetta(DE3)。
[0010] 而且，所述工程菌的載體為pET22b-cp1s8。
[0011] 上述基因工程菌發(fā)酵獲得的低溫蛋白酶。
[0012] 而且，所述酶最適催化pH值為10,最適催化溫度為37±5°C，在20~30°C之間保 持最尚酶活的50%以上。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：
[0014] 1、本發(fā)明從動(dòng)性球菌Planococcussp. 11815中克隆到一段新型低溫蛋白酶編碼 基因cpls8,序列分析表明：該基因所編碼的蛋白序列共含有329個(gè)氨基酸殘基，屬S8家族 絲氨酸蛋白酶，與目前數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表蛋白序列的最高源性僅為77 %。該基因在E.coil Rosseta(DE3)實(shí)現(xiàn)了功能表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)分析表明：其最適催化pH值為10,最適催化溫度 為37°C左右，在20~30°C之間可保持最高酶活的50%以上，因此屬典型的低溫堿性蛋白 酶，在洗滌、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0015] 2、本發(fā)明獲得的低溫蛋白酶的最適反應(yīng)pH值、最適作用溫度、熱穩(wěn)定性以及不同 金屬離子對酶活的影響進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示：該酶的最適pH值為10. 0左右，最適作用溫 度在36~38°C之間，在30°C條件下酶活仍保持在最高酶活的80%以上，當(dāng)反應(yīng)溫度超過 38°C時(shí)，隨著溫度的升高，酶活力逐漸下降，當(dāng)溫度達(dá)到50°C以上時(shí)，酶活基本喪失；酶的 熱穩(wěn)定性研宄表明：重組蛋白酶在l〇°C條件下比較穩(wěn)定，保溫2h后酶活仍能達(dá)到90%以 上，37C保溫lh后，殘余酶活為60 %左右，45C保溫30min，殘留酶活為37%，保溫lh后，殘 余酶活僅為15% ;因此屬于典型的低溫堿性蛋白酶。不同的金屬離子對酶活也有一定的影 響；金屬離子Ca2+對該重組蛋白酶有激活作用，Mn2+對酶活基本沒有影響；Mg2+、Ba2+、Fe3+、 Zn2+、C〇2+、Zn2+則對其有一定的抑制作用，Ni2+對其抑制作用最強(qiáng)，濃度為1. 0mm〇l/L的Ni2+ 可抑制90%以上的酶活。
【附圖說明】
[0016] 圖1為重組質(zhì)粒pET-22b-cpls8的構(gòu)建；
[0017] 圖2為低溫蛋白酶CPLS8在大腸桿菌中的表達(dá)及SDS-PAGE檢測圖；
[0018] 圖3為低溫蛋白酶CPLS8純化后的SDS-PAGE檢測圖；
[0019] 圖4為低溫蛋白酶CPLS8的最適作用溫度檢測；
[0020] 圖5為低溫蛋白酶CPLS8的熱穩(wěn)定性檢測；
[0021] 圖6為低溫蛋白酶CPLS8的最適作用pH檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] -、本發(fā)明的目的在于采用分子生物學(xué)手段克隆了來自深海沉積物的細(xì)菌 Planococcussp. 11815的新型低溫蛋白酶編碼基因cpls8,該基因所編碼的蛋白序列共含 有329個(gè)氨基酸殘基，屬S8家族絲氨酸蛋白酶，與目前數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表蛋白序列的最高源 性僅為77%，因此屬于新型低溫蛋白酶。所述菌株P(guān)lanococcussp. 11815的保藏日期為 2013年08月29日，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏 編號(hào)為：CGMCCNo. 8088,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為：動(dòng)性球菌 Planococcussp.
[0024] 二、本發(fā)明提供海洋細(xì)菌新型低溫蛋白酶編碼基因的克隆及其在大腸桿菌中進(jìn)行 功能表達(dá)的方法。
[0025] 1、蛋白酶編碼基因cpls8的克?。焊鶕?jù)對來自于南印度洋深海沉積物中的菌株 Planococcussp. 11815 (所述菌株保藏日期為2013年08月29日，保藏單位為：中國微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 8088,地址：北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為：動(dòng)性球菌Planococcussp.)的菌株鑒定結(jié)果以及所產(chǎn) 蛋白酶的序列分析結(jié)果，設(shè)計(jì)了兼并性引物：
[0026]cpls8Fl :5, -CGAATTRTWGGTGGGAAAAACT-3'
[0027]cpls8Rl :5' -TGYGGYGTYGCCATTGAAGT-3'
[0028] 然后，以Planococcussp. 11815的全基因組為模板，通過PCR技術(shù)克隆到cpls8基 因中565bp的一段保守區(qū)。PCR擴(kuò)增條件為：95°C5分鐘，95°C30秒，55°C30秒，72°C1分 鐘，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸5分鐘。根據(jù)對該保守區(qū)的測序及分析比對結(jié)果，重新設(shè)計(jì)引物：
[0029]cpls8F2 :5, -GATTATAACGGGCATGGCACC-3'
[0030]cpls8R2 :5' -CCGGACAGACTGGCATATTTC-3
[0031] 采用反向PCR的方法，分別獲得該保守區(qū)的上下游序列，包括該基因的表達(dá)調(diào)控 區(qū)。
[0032] 2、蛋白酶編碼基因cpls8在E.coliRosetta(DE3)中的表達(dá)：根據(jù)克隆基因cpls8 的0RF區(qū)序列，分別設(shè)計(jì)了上下游引物cplS8F-NdeI和cpls8R-Xh〇I，并在該引物的末端 添加了NdeI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)。
[0033] cpls8F-Nde I：
[0034] 5' -GGGAATTCCATATGAAAAATATTCATTTGATTCCATACCGC-3,
[0035]cpls8R-XhoI：
[0036] 5, -CCGCTCGAGCCGGTCCAATCCATTAGCATAAGA-3,
[0037]以Planococcussp. 11815的基因組為模板，采用PCR的方式擴(kuò)增出cpls8的開放 閱讀框（0RF)，回收PCR產(chǎn)物，并利用NdeI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)將其克隆至表達(dá)載 體pET22b上得到表達(dá)載體pET22b_cpls8。將表達(dá)載體pET22b_cpls8轉(zhuǎn)化至菌株E.coli Rosetta(DE3)中，接種于帶氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，200rpm，37°C震蕩培養(yǎng)，待0D600為 0. 6~1. 0時(shí)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)，收集菌體，重懸于Tris-HCl緩沖液 中（25mmol/LTris-HCl緩沖液，10mmol/LCaCl2，10%甘油，pH8.0)，超聲破碎，離心，取上 清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。
[0038] 3、重組蛋白的分離純化：
[0039] 首先用5倍株床體積的緩沖液（25mmol/LTris-HCl緩沖液，10mmol/LCaCl2,10% 甘油，pH8. 0)洗滌平衡Ni2+-NTA柱，流速lmL/min;然后將超聲裂解后的樣品12000r/min 離心10min。取上清，經(jīng)0. 45mm濾膜過濾后，流經(jīng)Ni2+-NTA柱，流速lmL/min;待樣品掛 柱后，分別采用含有不同濃度咪唑（20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、200mM)的緩沖液（25mM Tris-HCl緩沖液，10mm〇l/LCaC12，10%甘油，pH8.0)對掛柱蛋白進(jìn)行分步洗脫，各收集組 分經(jīng)SDS-PAGE檢測后，獲得純化的重組蛋白。
[0040] 4、重組蛋白的活性檢測及酶學(xué)性質(zhì)分析：
[0041] 本發(fā)明主要以suc-AAPF-pNa為底物進(jìn)行酶活的檢測，首先取50yL適當(dāng)稀釋的酶 液（25mmol/L的Tris-HCl, 10mmol/LCaC12，10%甘油，pH