用于在細菌表面呈遞目的蛋白的dna分子及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于在細菌表面呈遞目的蛋白的DNA分子及其應用。
【背景技術】
[0002] 細菌表面呈遞技術是運用DNA重組技術使外源的蛋白質或多肽以融合蛋白的形 式展示在細菌的表面，被展示的目標蛋白質或多肽可以保持相對獨立的空間結構和生物活 性，因此重組細菌就具有了該蛋白質和多肽的功能。更為重要的是，利用細菌表面呈遞技術 可以省去目標蛋白的提取純化等一系操作，直接用細胞進行后續研究和應用，方便快捷、經 濟實用。細菌表面展示系統呈現載體多樣性，有細菌外膜蛋白和脂蛋白系統，冰晶核蛋白系 統和自體運輸蛋白系統等。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種用于在細菌表面呈遞目的蛋白的DNA分子及其應用。
[0004] 本發明提供的DNA分子，自上游至下游依次包括N端信號肽的編碼序列、 Passenger結構域的編碼序列和C端跨膜轉運結構域的編碼序列；所述N端信號肽如序列 表的序列2所示；所述Passenger結構域如序列表的序列3所示；所述C端跨膜轉運結構域 如序列表的序列4所示。
[0005] 所述N端信號肽的編碼序列可如序列表的序列1自5'末端第4-129位核苷酸所 示。所述Passenger結構域的編碼序列可如序列表的序列1自5'末端第250-810位核苷 酸所示。所述C端跨膜轉運結構域的編碼序列可如序列表的序列1自5'末端第811-1650 位核苷酸所示。
[0006] 所述DNA分子中，在所述N端信號肽的編碼序列和所述Passenger結構域的編碼 序列之間，還可具有多克隆位點序列。所述多克隆位點序列可如序列表的序列1自5'末端 第199-249位核苷酸所示。
[0007] 所述DNA分子中，在所述N端信號肽的編碼序列和所述多克隆位點序列之間，還可 具有蛋白標簽的編碼序列。所述蛋白標簽具體可為His標簽。所述蛋白標簽的編碼序列具 體可如序列表的序列1自5'末端第181-198位核苷酸所示。
[0008] 所述DNA分子具體如序列表的序列1所示。
[0009] 含有以上任一所述DNA分子的重組質粒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的 保護范圍。
[0010] 所述重組質粒可為將以上任一所述DNA分子插入表達載體的多克隆位點得到的 重組質粒。所述重組質粒具體可為將以上任一所述DNA分子插入pET-22b(+)載體的多克 隆位點（如Ndel和Bpull02I酶切位點之間）得到的重組質粒pAutoDisplay。
[0011] 所述重組菌具體可為將以上任一所述重組質粒(如重組質粒pAutoDisplay)導入 宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌可為大腸桿菌，具體可為大腸桿菌C41 (DE3)。
[0012] 本發明還保護以上任一所述的DNA分子或以上任一所述重組質粒的應用；所述應 用為在細菌表面呈遞目的蛋白。所述細菌可為大腸桿菌，具體可為大腸桿菌C41(DE3)。所 述目的蛋白具體可為GFP蛋白或CotA蛋白。
[0013] 本發明還保護一種在細菌表面呈遞目的蛋白的方法，包括如下步驟：
[0014] ( 1)在以上任一所述重組質粒中插入目的蛋白的編碼基因，插入位點為所述N端 信號肽的編碼序列和所述Passenger結構域的編碼序列之間；
[0015] (2)將步驟（1)得到的質粒導入宿主細菌；
[0016] (3)培養步驟（2)得到的細菌，從而在細菌表面呈遞所述目的蛋白。
[0017] 所述步驟（1)中，所述插入位點具體可位于所述DNA分子的多克隆位點序列中。
[0018] 所述步驟（2)中，所述宿主細菌可為大腸桿菌，具體可為大腸桿菌C41(DE3)。
[0019] 所示步驟（3)中，所述培養中包括IPTG誘導的步驟。所示步驟（3)中，所述培養的 方法具體如下：將步驟（2)得到的細菌接種至LB液體培養基，37°C培養至0D6(l(lnm=0. 8-1. 0， 然后加入IPTG并使其濃度為0. 2mM，繼續37°C、220rpm振蕩培養4小時。
[0020] 所述目的蛋白具體可為GFP蛋白或CotA蛋白。所述目的蛋白的編碼基因具體可 為序列表的序列5所不的GFP基因或序列表的序列6所不的CotA基因。
[0021] N端信號肽通過Sec(Secretion)依賴途徑運輸融合蛋白通過細胞內膜到達周質 腔，信號肽被切掉。C端跨膜轉運結構域在外膜上組裝折疊成桶狀結構。Passenger結構 域通過桶狀結構形成的通道被輸送到細菌表面。蛋白標簽的作用是便于檢測目的蛋白是否 呈遞到細菌表面。多克隆位點序列便于不同異源蛋白表達載體的構建，以使操作過程簡潔 方便。
[0022] 本發明的有益效果及優點如下：
[0023] ( 1)本發明提供的DNA分子實現將目的蛋白運輸至細胞外膜和通過外膜分泌所需 要的所有信息都集中在其本身，不需要其它蛋白的輔助；
[0024] (2)本發明提供的DNA分子可用于各種目的蛋白的細菌表面呈遞，具有非常良好 的通用性。
[0025] 采用本發明提供的DNA分子或方法將目的蛋白呈遞到細菌表面，可用于全細胞生 物催化，例如將CotA蛋白呈遞到大腸桿菌表面，可以作為具有降解多環染料功能的全細胞 生物催化劑。本發明為進一步開發應用于工業生產的全細胞生物催化劑打下了堅實的基 礎。本發明在全細胞生物催化、環境生物吸附劑的開發、抗體制備等眾多領域具有潛在的應 用價值。
【附圖說明】
[0026] 圖1為重組質粒pAutoDisplay的結構示意圖。
[0027] 圖2為實施例2中的Westernblot結果。
[0028] 圖3為實施例2中的熒光照片。
[0029] 圖4為實施例3中的Westernblot結果。
[0030] 圖5為實施例3中的酶活檢測結果。
【具體實施方式】
[0031] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0032]ABTS,英文全稱為 2, 2 ' -Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6_sulfonic acid)diammoniumsalt,中文全稱為2, 2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨 鹽：Sigma，HPLC級純度。pET_22b(+)載體：MerckNovagen，69744。大腸桿菌Oil(DE3): Lucigen,60442。Trypsin:Merck,108367。
[0033] 實施例1、重組質粒(細菌表面呈遞載體）的構建
[0034] 1、合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子。
[0035] 序列表的序列1中，自5'末端第4-129位核苷酸為N端信號肽的編碼序列，第 181-198位核苷酸為His標簽（由六個組氨酸殘基組成）的編碼序列，第199-249位核苷酸 為多克隆位點序列，第250-810位核苷酸為Passenger結構域的編碼序列，第811-1650位 核苷酸為C端跨膜轉運結構域的編碼序列。
[0036] 2、將步驟1合成的雙鏈DNA分子插入pET-22b(+)載體的Ndel和Bpull02I酶切 位點之間，得到重組質粒pAutoDisplay。重組質粒pAutoDisplay的結構示意圖見圖1。
[0037] 實施例2、在細菌表面呈遞綠色熒光蛋白（GFP蛋白）
[0038] 1、將序列表的序列5所示的GFP基因插入重組質粒pAutoDisplay的BamHI和Xhol 酶切位點之間，得到重組質粒pAutoDisp1ay-GFP。
[0039]2、將步驟1得到的重組質粒導入大腸桿菌C41 (DE3)，得到重組菌。
[0040] 3、將步驟2得到的重組菌接種至LB液體培養基，37°C培養至0D6(l(lnm=0. 8-1. 0,然后 加入IPTG并使其濃度為0. 2mM，繼續37°C、220rpm振蕩培養4小時。
[0041] 4、完成步驟3后，取兩份菌液(每份400111)，41：、200(^離心10分鐘，收集菌體， 每份菌體用200ylPBS緩沖液（pH7. 4)重懸。
[0042] 5、取一份步驟4得到的菌液，加入4iai0mg/mlTrypsin溶液然后37°C水浴10分 鐘,然后迅速置于4°C并加入20ill胎牛血清以終止反應，然后2000g離心5分鐘收集菌體， 然后用含l〇%FBS的PBS緩沖液（pH7. 4)洗滌3遍，然后用PBS緩沖液（pH7. 4)洗滌一遍，然 后用200iUPBS緩沖液（pH7. 4)重懸。
[0043] 6、取另一份步驟4得到的菌液，加入4iU PBS緩沖液（pH7.4)然后37°C水浴消化 10分鐘，然后迅速置于4°C并加入20 ii 1胎牛血清以終止反應，然后2000g離心5分鐘收集 菌體，然后用含10%FBS的PBS緩沖液（pH7. 4)洗滌3遍，然后用PBS緩沖液（pH7. 4)洗滌一 遍，然后用200ylPBS緩沖液（pH7. 4)重懸。
[0044] 7、分別取步驟5得到的菌液(實驗組）和步驟6得到的菌液(對照組)，進行 12%SDS-PAGE和westernblot。采用的一抗為1:3000倍稀釋的鼠源His抗體（Sigma， H1029)，采用的二抗為1:5000倍稀釋的辣根過氧化氫酶標記的羊抗鼠二抗。
[0045]Trypsin消化的原理：在不破壞整個細胞的情況下，Trypsin可以將分泌至細菌表 面的蛋白消化，通過實驗組和對照組的比較，可以判斷該蛋白是否分泌到細菌表面，實驗組 細菌表面的蛋白會被消化，Westernblot圖譜中不顯示目的條帶，對照組細菌表面的蛋白 沒有被消化，在Westernblot圖譜中顯示目的條帶。
[0046] 序列1編碼的融合蛋白中的C端跨膜轉運結構域在外膜上組裝折疊成桶狀結構， Passenger結構域上游的片段(含Passenger結構域）通過桶裝結構被輸送到