葡萄糖異構酶、基因、突變體、工程菌及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及葡萄糖異構酶基因、突變體，和產葡萄糖異構酶基因工程菌及其構建 方法和應用，屬于基因工程領域。 (二） 技術背景
[0002] 葡萄糖異構酶（Glucoseisomerase，簡稱GI，EC5. 3. 1. 5)，又稱木糖異構酶 (Xyloseisomerase，XI)，能夠催化D-葡萄糖和D-木糖的異構化反應，分別轉化為D-果糖 和D-木酮糖，是食品工業領域重要的生物催化劑之一，尤其是在生物轉化制備高果糖漿的 工藝中具有關鍵的作用。
[0003] 高果糖漿（HFCS)是葡萄糖和果糖混合物，也稱果葡糖漿，是一種重要的甜味劑。 根據果糖的含量，高果糖漿可分為三種類型，HFCS-42(果糖42%、葡萄糖53%、多聚糖 5% )、HFCS-55(果糖55%、葡萄糖42%、多聚糖3% )和HFCS-90(果糖90%，葡萄糖9%， 多聚糖1% )。HFCS-90主要是通過HFCS-42分離、濃縮、純化制得，直接作為添加劑使用較 少，一般用于制備HFCS-55。HFCS-55 -般是由HFCS-90與HFCS-42混合制成。自從上世紀 六十年代作為一種甜味劑被應用于食品領域，高果糖漿的市場需求逐年增加，探索其工業 化生產的方法也層出不窮。目前制備高果糖漿的方法主要有化學法、發酵法和酶法。其中 應用葡萄糖異構酶生物轉化法生產的HFCS-42是目前市場上高果糖漿的主要來源。
[0004] 葡萄糖異構酶催化D-葡萄糖異構化是一個熱力學平衡反應。葡萄糖異構酶（第 一類GI) -般在高于60°C左右時催化活性降低，轉化率最高達到42~45%，因此，只能用 來制得HFCS-42。若能篩選到耐高溫的葡萄糖異構酶（第二類GI)，可將反應溫度提高至 85°C以上，促進D-葡萄糖向D-果糖的轉化，從而提高轉化率至55%以上，因此可以直接生 產HFCS-55。
[0005] 目前已經有一些耐高溫葡萄糖異構酶的報道，例如來自于阿波羅棲熱袍菌 ThermotoganeapolitanaDSM5068和海棲熱袍菌ThermotogamaritimeDSM3109 的葡萄 糖異構酶，其最適反應溫度分別達到了 97°C和105°C。然而，有些耐高溫的葡萄糖異構酶耐 酸能力較弱，在堿性條件下會催化生成有色物質阿洛酮糖。目前商業化生產的葡萄糖異構 酶難以滿足HFCS-55生產的需求。因此篩選出新型的表達耐高溫的葡萄糖異構酶基因，并 通過基因工程技術構建高表達的基因工程菌在HFCS-55的制備中具有重要的意義。 (三）
【發明內容】
[0006] 本發明目的是提供一種葡萄糖異構酶、編碼基因、重組載體、基因工程菌及其突變 體，以及葡萄糖異構酶基因工程菌在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中的應用，本發明提 供的通過重組大腸桿菌高效表達的耐高溫葡萄糖異構酶，解決了一般的葡萄糖異構酶最適 反應溫度低的問題，同時經過突變改造后的葡萄糖異構酶突變體能使D-葡萄糖的轉化率 達到55. 4%，為高果糖漿（HFCS-55)的大規模生產提供了良好的技術支持。
[0007] 本發明采用的技術方案是：
[0008] 本發明涉及一種葡萄糖異構酶，所述酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發明涉及一種葡萄糖異構酶編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0010] 本發明還涉及一種含所述葡萄糖異構酶基因的重組載體，由所述重組載體構建的 重組基因工程菌。
[0011] 本發明還提供一種所述葡萄糖異構酶編碼基因在制備葡萄糖異構酶中的應用，所 述的應用為：構建含有所述葡萄糖異構酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿 菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，取培養液分離得到含葡萄糖異構酶的菌體細 胞。
[0012] 本發明涉及一種所述葡萄糖異構酶在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中的應 用，所述的應用為：以含葡萄糖異構酶基因的重組工程菌經發酵培養獲得的濕菌體為酶源， 以D-葡萄糖為底物，以鎂鹽和鈷鹽為助劑，以去離子水為反應介質，在55~100°C(優 選80~95°C，最優選90°C)、150r/min條件下反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得 D-果糖；所述底物初始濃度為50~500g/L去離子水，濕菌體的質量用量為20g/L去離子 水，所述鎂鹽終濃度為5~25mmol/L去離子水，鈷鹽終濃度為0. 1~5mmol/L去離子水。進 一步，優選所述底物初始濃度為l〇〇g/L去離子水，濕菌體的質量用量為20g/L去離子水，所 述鎂鹽和鈷鹽在反應體系中物質的量終濃度分別為15mmol/L去離子水和lmmol/L去離子 水。
[0013] 本發明葡萄糖異構酶在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中所用酶源的制備方法 為：將含萄萄糖異構酶基因的重組基因工程菌接種至含終濃度40yg/mL卡那霉素的LB液 體培養基，37°C、150r/min培養至0D_= 0. 8~1. 0,獲得種子液；將種子液以體積濃度2% 的接種量轉入含終濃度40yg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，于37°C、150r/min條件下 培養006(|(|=0.4~0.8，添加終濃度0.511111?了6,281：、1501'/111111誘導培養1011，獲得誘導 培養液，將誘導培養液離心，收集濕菌體，即為酶源。
[0014] 此外，本發明還提供一種葡萄糖異構酶突變體，所述突變體是將SEQIDNO. 2所示 氨基酸序列的139位和/或186位氨基酸進行單突變或雙突變獲得的，具體優選所述突變 體為下列之一 ：（1)將SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第139位的色氨酸突變為苯丙氨酸，氨 基酸序列為SEQIDNO. 7所示，核苷酸序列為SEQIDNO. 3所示；（2)將SEQIDNO. 2所示 氨基酸序列第186位的纈氨酸突變為絲氨酸，氨基酸序列為SEQIDNO. 8所示，核苷酸序列 為SEQIDNO. 4所示；（3)將SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第186位的纈氨酸突變為蘇氨 酸，氨基酸序列為SEQIDNO. 9所示，核苷酸序列為SEQIDNO. 5所示；（4)將SEQIDNO. 2 所示氨基酸序列第139位的色氨酸突變為苯丙氨酸，同時將SEQIDNO. 2所示氨基酸序列 第186位的纈氨酸突變為蘇氨酸，氨基酸序列為SEQIDNO. 10所示，核苷酸序列為SEQID NO. 6所示。
[0015]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO. 1，SEQIDNO. 3,SEQIDNO. 4,SEQID NO. 5,SEQIDNO. 6所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬 于本發明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核 苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺 失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能 是一個多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的氨基酸的功能。
[0016] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO. 2,SEQIDNO. 7,SEQIDNO. 8， SEQIDNO. 9,SEQIDNO. 10所示氨基酸序列的多肽的片段或其變體，如其保守性變體、生物 活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在95%以上， 均屬于本發明保護范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或 替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性 質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0017] 本發明涉及所述葡萄糖異構酶突變體編碼基因，編碼基因構建的重組載體以及重 組載體轉化制備的重組基因工程菌。
[0018] 本發明涉及一種所述葡萄糖異構酶突變體在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖 中的應用，所述的應用為：以含葡萄糖異構酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經發酵培 養獲得的濕菌體為酶源，以D-葡萄糖為底物，以鎂鹽和鈷鹽為助劑，以去離子水為反應介 質，在50-100°C(優選90°C)、150r/min條件下反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得 D-果糖；所述鎂鹽終濃度為5~25mmol/L去離子水（優選15mmol/L)，鈷鹽終濃度為0. 1~ 5mmol/L去離子水（優選2mmol/L)。進一步，在優選條件下，反應5h，轉化率高于55%，反 應在1.5h趨于平衡。
[0019] 進一步，所述葡萄糖異構酶突變體在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中所用酶 源按如下步驟制備：將含萄萄糖異構酶突變體編碼基因的重組基因工程菌接種至含終濃度 40yg/mL卡那霉素的LB液體培養基，37°C、150r/min培養至0D6QQ=0. 8~1. 0,獲得種子 液；將種子液以體積濃度2%的接種量轉入含終濃度40 y g/mL卡那霉素的LB液體培養基 中，于37°C、150r/min條件下培養 0D6QQ= 0?4~0?8,添加終濃度 0?5mM IPTG，28