一種環孢菌素的合成方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥物合成技術領域，尤其涉及一種環孢菌素的合成方法。
【背景技術】
[0002]環孢菌素(又名環孢菌素A)是20世紀70年代發現的一組環狀i^一肽物質，其中的環孢菌素A已作為高效免疫抑制劑廣泛應用于器官移植，在世界市場的年銷售額已達到10億美元以上。環孢菌素作為高效免疫抑制劑廣泛應用于器官移植術，它的問世引起了器官移植領域的一場革命，使尸體來源和活體來源腎移植一年的存活率分別從53%和78%提高到80%和90%，使肝移植患者5年的存活率從原來的20%提高到70%，并使心肺聯合移植等手術得以廣泛開展。除免疫抑制作用外，環孢菌素還有一系列其它生物活性，如治療紅斑狼瘡、牛皮癬等自身免疫系統疾病，抑制HIV-1病毒，逆轉腫瘤多藥耐藥等。
[0003]由于環孢菌素中含有多種N-甲基化氨基酸，難以用通用的多肽縮合試劑合成，目前環孢菌素的生產工藝均采用微生物發酵法，但是由微生物發酵法制備生產只能得到少數幾種環孢菌素，難以構建藥物篩選所需的大規模多肽化合物庫。美國化學家丹尼雪夫斯基課題組在2010年嘗試以異腈縮合反應在液相條件下合成環孢菌素A全序列。但是這種方法需要多種縮合試劑，并且在微波加熱的條件下才能縮合成功，該制備工藝苛刻、難度高，因此難以推廣應用于快速制備環孢菌素全序列。而目前還沒有用固相多肽合成技術合成環孢菌素全序列的報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種環孢菌素的合成方法，旨在解決現有技術合成環孢菌素條件苛刻、難度高，且無法實現固相合成的問題。
[0005]本發明是這樣實現的，一種環孢菌素的合成方法，包括以下步驟:
[0006]提供Fmoc基團保護的肼樹脂；
[0007]米用三光氣作為縮合試劑，固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅樹脂；
[0008]將所述H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂進行氧化活化處理，得到環孢菌素。
[0009]本發明提供的環孢菌素的合成方法，采用三光氣作為縮合試劑，能在室溫條件下將氨基酸的羧基直接轉變為高活性的酰氯，從而使得環孢菌素的N-甲基化氨基酸能夠在非常溫和的條件下將氨基和羧基縮合成酰胺鍵，從而使固相合成環孢菌素全序列得以實現；同時，本發明采用金屬制品作為環孢菌素固相合成的載體樹脂，該樹脂的特殊連接官能團，使得合成的 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂在氧化活化處理步驟中，可在切割的同時、直接將多肽兩端游離的氨基和羧基首尾相連形成環肽，從而一步實現切割和閉環反應，簡化了操作程序，同時避免了液相縮合成環過程中的多聚縮合副反應。
【附圖說明】
[0010]圖1是本發明實施例提供的環孢菌素合成方法流程示意圖；
[0011]圖2是本發明實施例提供的固相合成環孢菌素的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0012]為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0013]本發明實施例使用的英文縮寫的含義如下:
[0014]BCT:三光氣；
[0015]DCM: 二氯甲烷；
[0016]Fmoc:2，2，4，6，7_ 五甲基苯并呋喃；
[0017]NBS:N-溴代丁二酰亞胺；
[0018]DMF:N, N- 二甲基甲酰胺；
[0019]DIEA:N, N’ - 二異丙基乙胺。
[0020]本發明實施例提供了一種環孢菌素的合成方法，包括以下步驟，如圖1所示:
[0021]S01.提供Fmoc基團保護的肼樹脂；
[0022]S02.線形肽的合成:采用三光氣作為縮合試劑，固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅樹脂；
[0023]S03.環抱菌素的合成:將所述 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVa1-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂進行氧化活化處理，得到環孢菌素。
[0024]具體地，上述步驟SOl中，所述肼樹脂為含有肼基的載體樹脂，本發明實施例以肼樹脂作為固相合成的載體樹脂，一方面，提供了多肽固相合成所需的活性基團，更重要的是，米用餅樹脂偶聯得到的線性妝 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂，在進行下述步驟的裂解切割中，能直接將多肽兩端游離的氨基和羧基首尾相連形成環肽，從而一步實現切割和閉環反應。
[0025]所述肼樹脂的選擇不受限制，本領域內常用的肼樹脂均在本發明實施例的保護范圍內。作為優選實施例，所述肼樹脂可選用苯肼樹脂。
[0026]上述步驟SOl中，所述肼樹脂的替代度對后期環孢菌素組成氨基酸或氨基酸片段的偶聯率會有一定的影響。當肼樹脂的替代度過高時，反應基團在樹脂上的密度過大，隨著偶聯的發生，多肽肽鏈逐漸增長，因此，其空間位阻會越來越大，這將增加后續氨基酸或氨基酸片段的偶聯難度，導致部分肽鏈的偶聯中斷，從而降低了多肽合成的合成效率，浪費了原料，更重要的是，在后續的裂解切割過程中，這些被中斷的肽鏈將連同環孢菌素一起切割下來，成為目的產物環孢菌素的雜質，且雜質類型多種多樣，增加了環孢菌素的純化難度；當肼樹脂的替代度過低時，合成一定量的環孢菌素所需要的數值量將增加，從而提高了生產成本。為了同時解決上述問題，經過發明人反復研究發現，本發明實施例所述肼樹脂的替代度為0.2?1.0mmol/go作為進一步優選實施例，所述肼樹脂的替代度為0.2?0.6mmol/g°
[0027]在進行步驟S02前，上述肼樹脂需要進行溶脹處理，所述溶脹處理采用二氯甲烷試劑進行。溶脹處理方法不受限制，本領域常用方法均在本發明實施例保護范圍內。
[0028]為了避免上述肼樹脂在偶聯氨基酸或氨基酸片段前，其反應基團發生化學反應失效，應采用Fmoc保護基團將所述肼樹脂進行保護。
[0029]上述步驟S02 中，所述固相合成 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂的步驟中，為了節省生產成本,在所述Fmoc基團保護的肼樹脂上可采用逐一偶聯的方式依次偶聯Fmoc基團保護的D_Ala、MeLeu、Meleu、MeVal、MeBmt、Abu、MeGly、MeLeu> Val、Meleu、Ala合成線性肽。當然，也可以根據實際需要，將合成得到的滿足環孢菌素序列的氨基酸片段進行Fmoc保護后，再在所述Fmoc基團保護的肼樹脂上依次偶聯Fmoc保護的氨基酸片段。上述氨基酸片段的組合形式及其個數不受限制，只需符合環孢菌素的氨基酸序列即可。本發明實施例中，為了降低環孢菌素的合成成本，優選采用逐一偶聯氨基酸的方式合成 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅樹脂。本發明實施例中，上述固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼樹脂的步驟中，在每次偶聯氨基酸或氨基酸片段時，需將連載樹脂上的反應基團或已部分偶聯的氨基酸肽鏈進行去除Fmoc保護處理，本發明實施例中，所述Fmoc基團保護的去除試劑為含體積分數為20%的哌啶的DMF。所述處理方式不受限制，本領域常用的去除Fmoc保護處理均能用于本發明實施例。
[0030]本發明實施例中，由于所要合成的環孢菌素中含有7個N-甲基化的氨基酸，通用的多肽縮合試劑難以合成，其液相合成難度巨大，且多肽縮合試劑需要的種類多，固相合成更是難以企及。因此，環孢菌素的合成停滯在微生物發酵法。有鑒于此，發明了經過反復的實驗、摸索，將用作液相反應介質的三光氣作為本發明實施例多肽固相合成的縮合試劑。本發明實施例中，三光氣能在室溫條件下將氨基酸的羧基直接轉變為高活性的酰氯，從而使得環孢菌素的N-甲基化氨基酸能夠在非常溫和的條件下將氨基和羧基縮合成酰胺鍵，從而使固相合成環孢菌素全序列得以實現。
[0031]上述固相合成步驟中，在所述Fmoc基團保護的肼樹脂上逐一偶聯氨基酸片段或單個氨基酸的方法不受限制，本領域內常用的多肽固相合成方法適用于本發明實施例。作為具體實施例，上述偶聯反應的方法可以為將所述Fmoc基團保護的肼樹脂加入到固相反應柱中，采用Fmoc去除試劑脫除Fmoc保護基后，用洗滌試劑進行清洗，洗滌試劑可采用本領域常用的洗滌試劑，如DMF、DCM等。取與肼樹脂摩爾質量比為(1-3):1的