纖維二糖水解酶變體和編碼它們的多核苷酸的制作方法
【專利說明】纖維二糖水解酶變體和編碼它們的多核苷酸
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包括一個計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結合在此。
[0003] 發明背景 [0004] 發明領域
[0005] 本發明涉及纖維二糖水解酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產生這些變體的方 法以及使用這些變體的方法。
[0006] 相關技術說明
[0007] 纖維素是單糖葡萄糖通過β -1，4-鍵共價連接的一種聚合物。許多微生物產生水 解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。 內切葡聚糖酶在任意位置消化纖維素聚合物，使其打開而被纖維二糖水解酶攻擊。纖維二 糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序地釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的一種水溶 性β -1，4-連接二聚體。β -葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。
[0008] 將木質纖維素原料轉化成乙醇具有如下優點，即易于獲得大量原料、避免燃燒或 填埋材料的期望性、以及乙醇燃料的清潔性。現在認為木材、農業殘余物、草本作物、和城市 固體廢物是生產乙醇的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將木質 纖維素轉化成可發酵糖（例如，葡萄糖），那么這些可發酵糖就容易地被酵母發酵成乙醇。
[0009] WO 2011/050037披露了具有纖維二糖水解酶活性和改進的熱穩定性的土生梭孢 霉纖維二糖水解酶變體。WO 2011/050037披露了具有纖維二糖水解酶活性和改進的熱穩定 性的煙曲霉纖維二糖水解酶變體。WO 2005/028636披露了紅褐肉座菌Cel7A纖維二糖水解 酶I的變體。WO 2005/001065披露了灰腐質霉Cel7A纖維二糖水解酶I、紅褐肉座菌纖維 二糖水解酶I和嗜熱革節孢（Scytalidium thermophilium)纖維二糖水解酶I的變體。WO 2004/016760披露了紅褐肉座菌Cel7A纖維二糖水解酶I的變體。美國專利號7, 375, 197 披露了里氏木霉纖維二糖水解酶I的變體。
[0010] 本領域需要具有改進的特性的纖維二糖水解酶變體以增加木質纖維素原料的糖 化效率。
[0011] 本發明提供了具有增加的比活性的纖維二糖水解酶變體。
[0012] 發明概述
[0013] 本發明涉及分離的纖維二糖水解酶變體，這些變體在對應于SEQ ID NO:2的成熟 多肽的位置38的位置處包括取代，其中這些變體具有纖維二糖水解酶活性。
[0014] 本發明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸；包括這些多核苷酸的核酸構建 體、表達載體和重組宿主細胞；以及產生這些變體的方法。
[0015] 本發明還涉及用于降解或轉化纖維素材料的方法，該方法包括：在本發明的纖維 二糖水解酶變體的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料。在一個方面中，這些方法進 一步包括回收該降解的或轉化的纖維素材料。
[0016] 本發明還涉及產生發酵產物的方法，這些方法包括：(a)在本發明的纖維二糖水 解酶變體的存在下，用一種酶組合物糖化一種纖維素材料；(b)用一種或多種（例如，若干 種）發酵微生物發酵該糖化的纖維素材料，以產生該發酵產物；并且（C)從發酵中回收該發 酵產物。
[0017] 本發明還涉及發酵纖維素材料的方法，這些方法包括：用一種或多種（例如，數 種）發酵微生物發酵該纖維素材料，其中在本發明的纖維二糖水解酶變體的存在下用一種 酶組合物使該纖維素材料糖化。在一個方面，發酵纖維素材料產生發酵產物。在另一個方 面中，這些方法進一步包括從發酵中回收該發酵產物。
[0018] 附圖簡要說明
[0019] 圖1示出了在pH 5和25°C下5小時后，通過里氏木霉野生型纖維二糖水解酶I及 其W38A纖維二糖水解酶變體從微晶纖維素產生糖。將結果針對在對照樣品中確定的背景 糖加以校正。
[0020] 圖2示出了在pH 5和25°C下5小時后，通過里氏木霉野生型纖維二糖水解酶I及 其W38A纖維二糖水解酶變體從預處理的玉米秸桿（PCS)產生糖。將結果針對在對照樣品 中確定的背景糖加以校正。
[0021] 定義
[0022] 乙酰木聚糖酯酶：術語"乙酰木聚糖酯酶"意指一種羧酸酯酶（EC 3. 1.1. 72)，其 催化乙酰基從聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α -萘基乙酸酯以及對硝基苯基乙 酸酯的水解。出于本發明的目的，在含有0.01% TWEEN?20(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂 酸酯）的50mM乙酸鈉 （pH 5. 0)中使用0. 5mM乙酸對硝基苯酯作為底物來測定乙酰木聚糖 酯酶活性。將一個單位的乙酰木聚糖酯酶定義為在pH 5、25°C下每分鐘能夠釋放1微摩爾 對硝基酚根陰離子的酶的量。
[0023] 等位基因變體：術語"等位基因變體"意指占據同一染色體基因座的基因的兩種或 更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產生，并且可以導致群體內的多 態性。基因突變可以是沉默的（在所編碼的多肽中沒有改變）或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0024] a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶：術語" a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶"意指一種a -L-阿拉 伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶（EC 3. 2. 1. 55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中的末端非還原 性a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有（1，3)_和/或 (1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶還被稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿 拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯 糖苷酶、或a-L-阿拉伯聚糖酶。出于本發明的目的，使用每ml的IOOmM乙酸鈉 （pH 5) 中5mg的中等粘度小麥阿拉伯糖基木聚糖（麥格酶國際愛爾蘭股份有限公司（Megazyme International Ireland, Ltd.)，愛爾蘭威克洛郡布瑞公司（Bray, Co. Wicklow, Ireland)以 總體積200 μ 1在40°C下持續30分鐘，接著通過AMINEX? HPX-87H柱色譜（伯樂實驗 室有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.)，赫拉克勒斯，加州，美國）進行阿拉伯糖分析 來測定a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0025] α-葡糖醛酸糖苷酶：術語"α-葡糖醛酸糖苷酶"是指可催化a-D-葡萄 糖苷酸水解成為D-葡萄糖醛酸酯和醇的一種a-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶 (EC 3. 2. 1.139)。出于本發明的目的，根據德弗里斯（de Vries)，1998,細菌學雜志 (J.Bacteriol. ) 180:243-249來測定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一個單位的α-葡糖醛酸 糖苷酶等于能夠在pH 5、40°C下每分鐘釋放1微摩爾的葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶 的量。
[0026] β -葡糖苷酶：術語" β -葡糖苷酶"意指一種β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (E.C. 3. 2. 1.21)，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄 糖。出于本發明的目的，根據文丘里（Venturi)等人，2002,基礎微生物學雜志（J. Basic Microbiol. )42:55-66的程序使用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作為底物來測定 β-葡糖苷酶活性。一個單位的β-葡糖苷酶定義為在25°C、pH 4.8下，在含有0.01% TWEEN? 20的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每 分鐘產生1. 0微摩爾的對硝基苯酚陰離子。
[0027] β -木糖苷酶：術語" β -木糖苷酶"是指催化短β - (1 - 4)-低聚木糖的外切水 解，以從非還原末端除去連續的D-木糖殘基的β-D-木糖苷木糖苷酶（E. C. 3. 2. 1. 37)。 可以在含有0.01 % TWEEN? 20的IOOmM檸檬酸鈉中，在pH 5、40°C下，使用ImM對硝 基苯基-β-D-木糖苷作為底物測定β-木糖苷酶活性。一個單位的β-木糖苷酶定義 為在40°C、pH 5下，在含有0.01 % TWEEN? 20的IOOmM檸檬酸鈉中從ImM對硝基苯 基-β -D-木糖苷每分鐘產生I. 0微摩爾的對硝基酚根陰離子。
[0028] 碳水化合物結合結構域：術語"碳水化合物結合結構域"是指介導酶結合至纖維素 底物的非晶區域的酶的區域。碳水化合物結合結構域（CBD)典型地發現于酶的N末端處或 C末端的端點處。術語"纖維素結合結構域"在此也與術語碳水化合物結合結構域互換使 用。
[0029] 催化結構域：術語"催化結構域"意思指一種酶的包含該酶的催化機器的區域。在 一個方面中，催化結構域是SEQ ID Ν0:2的氨基酸1至429。在另一個方面中，催化結構域 是SEQ ID Ν0:8的氨基酸1至437。在另一個方面中，催化結構域是SEQ ID NO: 10的氨基 酸1至440。在另一個方面中，催化結構域是SEQ ID NO: 12的氨基酸1至437。在另一個方 面中，催化結構域是SEQ ID NO: 14的氨基酸1至437。在另一個方面中，催化結構域是SEQ ID NO: 16的氨基酸1至438。在另一個方面中，催化結構域是SEQ ID NO: 18的氨基酸1至 437。在另一個方面中，催化結構域是SEQ ID N0:20的氨基酸1至430。在另一個方面中， 催化結構域是SEQ ID NO:22的氨基酸1至433。
[0030] 催化結構域編碼序列：術語"催化結構域編碼序列"意指一種編碼催化纖維二糖 水解酶活性的結構域的多核苷酸。在一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID NO: 1的 核苷酸52至1469。在另一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID N0:3的核苷酸52至 1389。在另一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID N0:4的核苷酸52至1389。在另一 個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID N0:7的核苷酸79至1389。在另一個方面中，催 化結構域編碼序列是SEQ ID N0:9的核苷酸52至1371。在另一個方面中，催化結構域編碼 序列是SEQ ID NO: 11的核苷酸55至1425。在另一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID NO: 13的核苷酸76至1386。在另一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID NO: 15的 核苷酸76至1386。在另一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID NO: 17的核苷酸55至 1504。在另一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID NO: 19的核苷酸61至1350。在另 一個方面中，催化結構域編碼序列是SEQ ID N0:21的核苷酸55至1353。
[0031] cDNA:術語"cDNA"意指可以通過反轉錄從得自真核或原核細胞的成熟的、已剪接 的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相應基因組DNA中的內含子序列。早 先的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現為成熟的剪接的mRNA之前要經一系列的步 驟進行加工，包括剪接。
[0032] 纖維二糖水解酶：術語"纖維二糖水解酶"意指一種1，4- β -D-葡聚糖纖維二糖水 解酶（E. C. 3. 2. 1. 91和Ε. C. 3. 2. 1. 176)，其催化纖維素、纖維寡糖、或任何含有β -1，4-連 接葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從而從鏈的還原性末端（纖維二糖水 解酶I)或非還原性末端（纖維二糖水解酶II)釋放纖維二糖（泰里（Teeri)，1997,生物 技術趨勢（Trends in Biotechnology) 15:160-167;泰里等人，1998,生物化學學會會刊 (Biochem. Soc. Trans.) 26:173-178)。根據里弗（Lever)等人，1972,分析生物化學（Anal. Biochem. )47:273-279 ;范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982,歐洲生化學會聯合會快 報（FEBS Letters)，149:152-156 ;范?帝伯赫和克萊森斯（Claeyssens)，1985,歐洲生化 學會聯合會快報，187:283-288;以及湯美（Tomme)等人，1988,歐洲生物化學雜志（Eur. J. Biochem.) 170:575