胞瘤細胞，例如，嚙齒類動物神經 母細胞瘤細胞諸如大鼠或小鼠神經母細胞瘤細胞，也可以是猴神經母細胞瘤細胞，諸如恒 河猴、獼猴或食蟹猴神經母細胞瘤細胞或靈長類動物神經母細胞瘤細胞諸如黑猩猩神經母 細胞瘤細胞或，優選地，人神經母細胞瘤細胞。建立的神經母細胞瘤細胞系的實例涵蓋，例 如，Neur〇-2a (小鼠神經母細胞瘤）、KelIy (人神經母細胞瘤），SH-SY5Y (人神經母細胞瘤） 或SiMa(人神經母細胞瘤）。本發明的方法中優選使用人神經母細胞瘤細胞以生成神經毒 素敏感的、神經元分化的細胞。更優選地，如本文描述的神經母細胞瘤細胞是SiMa細胞或 SiMa細胞系。這因為SiMa細胞易于轉移，處于BoNT敏感的形式。此外，它們對BoNT具有 高敏感性。另外，較之其他神經母細胞瘤細胞或細胞系，SiMa細胞的分化方案簡單并且相 當短。如本發明的方法中使用的SiMa細胞可以是親本SiMa細胞或源自其的（亞）克隆。
[0029] 在本發明前述方法的步驟a)中，"培養"意為在引發所述腫瘤細胞神經元分化的 條件和時間下，在細胞培養基中培養如本文定義的能夠分化為神經元細胞的腫瘤細胞。如 細胞分化過程中所用的術語"引發（priming) "是本領域已知的；見，例如，Khoo等人，PLOS ONE 6(5) :el9025, (2011) ;Steindler, ILAR Journal 48(4),323-338(2007) ;Vazey 和 Connor, Stem Cell Research & Therapy 1:41(2010)。如本文所用"引發腫瘤細胞神經元 分化"表示通過提示的細胞培養條件、時間和細胞培養基，誘導如本文所定義的腫瘤細胞神 經元分化。所述引發腫瘤細胞的神經元分化可以，例如，通過在合適的細胞培養基中培養， 并且任選地，通過降低在細胞培養基中的血清和/或添加視黃酸進行。如本領域技術人員 所知的，其中所述腫瘤細胞"經誘導神經元分化"或"經引發神經元分化"的腫瘤細胞的分化 態的特征在于，例如，如本文別處示出的神經元誘導標志物的表達。如本領域技術人員顯而 易見的，腫瘤細胞的所述"經引發的"或"經誘導的"分化態，然而，還不代表由本文別處所示 出的特征定義的腫瘤細胞的最終神經元分化態，而是代表神經元分化譜系中的先前的分化 步驟。只有在進行了本發明的分化方法的步驟b)后，腫瘤細胞是最終分化的，即如本文指 明的神經元分化的細胞。在引發所述腫瘤細胞神經元分化的條件和時間下，在培養基中培 養如本文定義的腫瘤細胞意為在適當的細胞培養基中在37°C培養所述腫瘤細胞12小時至 7天，優選24小時至6天，更優選36小時至5天并且是本領域已知的。可用于引發所述腫 瘤細胞神經元分化的適當的細胞培養基（本文也稱為"引發培養基"）包括，例如，OptiMEM、 MEMa、RPMI_1640、最少必需培養基（MEM)、Ham' s F12 培養基、Dulbeccos 修改的 Eagle's Medium(DMEM)或DMEM:F12(1:1)。引發培養基可以包含本領域已知的其他組分，諸如血清 (例如FBS)、NEAA、視黃酸、生長因子（諸如NGF或FGF)、維生素、脂肪酸、激素和/或抗菌 素。用于引發SiMa細胞神經元分化的適當的細胞培養基包含，例如，80至98. 6% OptiMEM、 1至7. 5% FBS、0. 2至5% B27補充物、0. 2至5% N2補充物，和，任選地，0. 1至2. 5%非必 需氨基酸（NEAA)。有利地，本發明人已經發現，包含92,5%0PTI_MEM?、5%FBS、1^^ 必需氨基酸、1 % B-27補充物和0. 5% N-2補充物的細胞培養基特別適合于引發SiMa細胞， 如以下實施例中所示。為了引發SiMa細胞神經元分化，優選的培養時間是12小時至5天。 優選地，在如以下實施例中顯示的細胞培養條件下進行SiMa細胞的引發。為了引發P19細 胞，例如，可以使用90至99. 8% MEM-α、〇. 2至10% FBS，和0.001至10微摩爾（μ M)視黃 酸（RA)，優選地〇. 1 μ MRA。在此，培養時間優選地是3天至7天。
[0030] 如方法的步驟b)中所用的用于生成本發明的神經毒素敏感的、神經元分化的 細胞的術語"分化培養基"是具有100至270m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的細胞培養 基。優選地，分化培養基的重量摩爾滲透壓濃度在120至250m0sm/kg之間，更優選地在 150和240m0sm/kg之間，甚至更優選地在180m0sm/kg和230m0sm/kg之間，最優選地在 200和225m0sm/kg之間并且最優選約225m0sm/kg。如本文別處和以下實施例中所示出， 本發明人已經令人吃驚地發現，分化培養基的低重量摩爾滲透壓濃度是由本發明的方法生 產的神經毒素敏感的、神經元分化的細胞對BoNT的增加的敏感性的原因。可以使用例如， neurobasal培養基、MEM、DMEM:F12或本領域已知的任何基礎培養基作為分化培養基如果 調整至適當的重量摩爾滲透壓濃度，例如，通過降低培養基制劑中NaCl濃度或通過用水稀 釋培養基。此外，分化培養基包含至少一種補充物。補充物可以是（i)B27補充物，（ii) N2補充物，（iii)NS21補充物，或（iv)其組合。例如，B27補充物可以與N2補充物組合 使用。B27補充物是本領域已知的并且一般用于神經元的生長與維持。此外，B27補充物 是可商購的，例如，來自Life Technologies。通常，在本發明的方法中，B27補充物可以 以0.2%至5%的濃度使用。N2補充物（其可從例如，Life Technologies獲得）是基于 Bottenstein's N-I制劑的化學確定的，無血清補充物。N2補充物推薦用于生長和表達神經 母細胞瘤以及來自周圍神經系統（PNS)和中樞神經系統（CNS)的原代培養物中的有絲分裂 后神經元。在本發明的方法中N2補充物可以以0.2 %至5 %的濃度使用。NS21補充物是重 新定義的和修飾的B27補充物，其中21種不同的成分已經用于神經元培養物，例如如Chen 等人（2008)，Journal of Neuroscience Methods 171，239-247 的出版物中所描述。通常， 在本發明的方法中NS21補充物以0. 2 %至5 %的濃度使用。在上述分化培養基使用的其他 成分包含谷氨酰胺或GlutaMax，一種或多種抗菌劑、NEAA，FBS (0. 1至20% )、GTlb (0. 1至 300 μΜ)、視黃酸（RA) (1 納摩爾（nM)至 300 μΜ)、生長因子（諸如 100ng/ml NGF、40ng/ml BDNF、40ng/ml CNTF、5ng/ml LIF、5ng/ml⑶NF、TGF或FGF)或本領域已知的其他分化因子 (1% DMS0、lmM 雙丁酰 cAMP、lmM 丁酸鹽、5μg/ml 塞來昔布、Y-27632、SB431542,音猬因子 (sonic hedgehog) (SHH)等）。本發明此方法的步驟b)的細胞在所述分化培養基中優選培 養至少3天以獲得神經毒素敏感的、神經元分化的細胞。培養也可以更長，例如，至少3. 5 天、4天、4. 5天、5天、6天、7天（1周）、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天（2周）、 15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天（3周）或甚至更長。優選的是培養P19腫瘤細 胞2至3周，并且培養SiMa細胞3天至7天。允許神經元分化的優選的分化培養基和細胞 培養條件在以下實施例中顯示。優選地，所述神經元分化的細胞代表如本文別處定義的最 終分化的神經元細胞。
[0031] 術語"重量摩爾滲透壓濃度"如本文所用意為溶質濃度的測量，其可以定義為每千 克（kg)溶液的溶質的滲透壓摩爾（Osm)數（osmol/kg或Osm/kg)。溶液的重量摩爾滲透 壓濃度通常以Osm/kg表達。重量摩爾滲透壓濃度測量了每單位質量的溶液的溶質顆粒的 滲透壓摩爾數。摩爾滲透壓濃度是每升溶劑的溶質的滲透壓摩爾的測量（osmol/Ι或Osm/ 1)。重量摩爾滲透壓濃度和摩爾滲透壓濃度可以在滲透壓計上測量。
[0032] 在另外的方面，本發明的前述方法可以包含額外的步驟。例如，所述額外的步驟可 以涵蓋用于測定如本文定義的神經毒素多肽的生物學活性的步驟。為此，通過本發明的方 法獲得的或可獲得的神經毒素敏感的、神經元分化的細胞首先與神經毒素多肽相接觸。術 語"接觸"如根據本發明的方法所用指將前述細胞與神經毒素物理接近以允許物理和/或 化學和/或生物學相互作用。神經毒素可以由樣品，優選地生物學樣品諸如細胞、細胞裂解 物、血液、血漿、血清或淋巴液包含。允許特異性相互作用的合適的條件是本領域技術人員 熟知的。所述條件將依賴于待在本發明的方法中應用的細胞和神經毒素，并且可以由技術 人員不費力地調整。此外，技術人員也可以通過常規實驗測定足以允許相互作用的時間。例 如，可以將特別量的如本文定義的分離的或重組神經毒素多肽或其變體或包含神經毒素多 肽的樣品添加至神經毒素敏感的、神經元分化的細胞。此后，在允許神經毒素多肽發揮其生 物學活性的條件下，用神經毒素多肽孵育細胞至少24h，優選48h，更優選72h。如本文所用 的"允許神經毒素多肽發揮其生物學活性的條件"是本領域公知的。隨后，例如通過添加裂 解緩沖液終止細胞，并例如如以下實施例中所示測定神經毒素多肽的生物學活性。
[0033] 術語"神經毒素"、"神經毒素多肽"或"神經毒素蛋白"如本發明中所用指7種不同 血清型的肉毒梭菌神經毒素，即 BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/ G，以及指破傷風神經毒素（TeNT)，和其變體，如本文所定義。相應的核酸和氨基酸序列是本 領域已知的；見，例如，Uniprot或TREMBL序列數據庫。優選地，BoNT/A用于本發明的方法 中（W0 2009/114748)。所述神經毒素的相應的受體和底物已經在本文別處指出。神經毒素 多肽可以是天然存在的神經毒素或非天然存在的神經毒素。天然存在的神經毒素多肽是通 過天然存在的方法生產的，包括，例如，從翻譯后修飾、可變剪接的轉錄物或自發突變生產 的同種型和亞型。例如，BoNT/A亞型是BoNT/Al亞型、BoNT/A2亞型、BoNT/A3亞型、BoNT/ A4亞型或B〇NT/A5亞型。天然存在的神經毒素多肽包括上述序列，其中添加、取代或缺失 了 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或更多個氨基酸殘基。已經在引導部分中提 及了包含天然存在的BoNT/A的可商購的藥物組合物。非天然存在的神經毒素多肽意為其 結構在人為操縱的幫助下被修改的任何神經毒素多肽，包括，例如，通過使用隨機誘變或理 性設計的基因工程生產的具有改變的氨基酸序列的神經毒素多肽，和通過化學合成生成的 神經毒素多肽。現有技術中已經描述了此類非天然存在的神經毒素多肽。
[0034] 在本發明的另一個方面，如本文所定義的，神經毒素多肽具有與BoNT/A、BoNT/B、 BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G，或破傷風神經毒素的氨基酸序列至少40%、至 少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 98%或至少99%相同的氨基酸序列。如本發明所用相同指氨基酸序列的序列同一性，其中 比對序列從而獲得最高的順序匹配。這能夠通過使用公開的技術或計算機程序編碼的方 法來實現，諸如，例如 BLASTP、BLASTN