誘導針對所有登革熱病毒血清型的免疫性的疫苗及制造疫苗的方法
【專利說明】誘導針對所有登革熱病毒血清型的免疫性的疫苗及制造疫 苗的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2011年10月25日提交的美國臨時專利申請No. 61/550, 982的優 先權和權益，所述美國臨時專利申請以其全文通過引用并入本文之中。
[0003] 政府支持
[0004] 本發明是根據國防威脅降低局（Defense Threat Reduction Agency)批準的合作 協議第HDTRA1-10-1-0009號在政府支持下作出的。政府可能享有本發明的某些權利。
【背景技術】
[0005] 登革熱病毒（DENV)為黃病毒屬的成員，是世界各地的熱帶和亞熱帶地區中蚊子 傳播的病毒性疾病的最常見原因。每年有約5000萬-1億人感染DENV。DENV感染可以是 無癥狀的，但最常見的是表現為登革熱（DF)，一種自限性疾病。登革出血熱（DHF)和登革休 克綜合征（DSS)是登革熱感染的更嚴重并且威脅生命的表現。DENV造成了任何蚊子傳播的 病毒性病原體的最大社會和經濟負擔之一。沒有對感染的特異性治療，而且已經證明通過 接種疫苗來控制登革熱病毒是難以實現的。DHF/DSS的發病機理沒有被完全理解。登革熱 病毒有四種血清型（DENV-l，DENV-2，DENV-3和DENV-4)。一種血清型的感染能夠賦予終生 的同型免疫性，但是對于異型血清型只有短期（約三至六個月）的交叉保護。
[0006] 在具有多于一種的循環血清型的對象中發生二次異型感染期間，嚴重疾病的風險 是最大的。有證據表明，先前感染一種類型能夠在后續感染不同的血清型期間產生可以加 劇或增強疾病進程的抗體應答。疫苗組分能夠引起增強性抗體應答（與保護性應答相反） 的可能性已經成為設計和測試疫苗以保護不受登革熱感染中的主要擔憂。因此，對于可以 有效針對不同的血清型并且不會增強DENV感染進程的疫苗，存在著需求。
【發明內容】
[0007] 本文描述了形成嵌合蛋白的方法，其包括以下步驟：提供具有SEQ ID NO. 1的黃熱 病毒17-D包膜蛋白；提供選自SEQIDN0·2、SEQIDN0·3、SEQIDN0·4或SEQIDN0·5的 登革熱病毒包膜蛋白；以及使 SEQ ID N0.1 的第 1-11、28-30、32、42、44、46、70-81、95-99、 110-115、142-147、149-157、236-242、304-324、333、335、337、350-352、355、356、362-370、 377、379、386、388-393位氨基酸中的一個或多個被所選擇的登革熱病毒包膜蛋白的相應氨 基酸取代以制造嵌合包膜蛋白。
[0008] 本文還描述了制造治療組合物的方法，其包括以下步驟：提供來自于黃病毒的包 膜蛋白的一部分；提供選自 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 的登 革熱病毒包膜蛋白；使黃病毒的包膜蛋白氨基酸的一部分被所選擇的登革熱病毒的相應包 膜蛋白氨基酸取代以制造嵌合包膜蛋白；提供藥學上可接受的賦形劑；以及將嵌合包膜蛋 白和賦形劑混合。
[0009] 本文進一步描述了嵌合蛋白，其包含：由具有SEQ ID NO. 1的黃熱病毒17-D包膜 蛋白組成的包膜蛋白，其中黃熱病毒17-D包膜蛋白的所選擇的氨基酸被選自SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5的登革熱病毒包膜蛋白的相應氨基酸取代。 [0010] 本文還描述了用于治療登革熱病毒的組合物，其包含：由黃病毒包膜蛋白組成的 嵌合包膜蛋白，其中黃病毒包膜蛋白的所選擇的氨基酸被選自SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5的登革熱病毒包膜蛋白的相應氨基酸取代；以及藥學上可接 受的賦形劑。
【附圖說明】
[0011] 圖1顯示了用固定化的病毒包膜糖蛋白、患者血清和來自于DENV感染患者的單克 隆抗體所進行的ELISA測定的結果。
[0012] 圖2顯示了將DENV-I至4感染的LLC-MK-2細胞暴露在來自于DENV感染患者的 單克隆抗體下所進行的免疫熒光測定的結果。
[0013] 圖3顯示了用DENV-I至4感染的LLC-MK-2細胞、患者血清、來自于DENV感染患 者的單克隆抗體所進行的中和測定的結果。
[0014] 圖4顯示了在存在來自于DENV感染患者的單克隆抗體的情況下所進行的增強測 定的病毒攝取結果。
[0015] 圖5顯示了在存在來自于DENV感染患者的單克隆抗體的情況下所進行的病 毒-細胞結合抑制測定的結果。
[0016] 圖6顯示了在存在來自于DENV感染患者的單克隆抗體的情況下所進行的病 毒-脂質體結合抑制測定的結果。
[0017] 圖7顯示了使用純化的DENV-2進行的并使用來自于DENV感染患者的單克隆抗體 進行探測的蛋白質免疫印跡測定的結果。
[0018] 圖8顯示了使用可溶性蛋白E進行的并使用來自于DENV感染患者的單克隆抗體 進行探測的蛋白質免疫印跡測定的結果。
[0019] 圖9顯示了表位作圖的結果，并給出了來自于DENV感染患者的單克隆抗體對于可 溶性蛋白E的解離常數。
[0020] 圖10顯示了用來自于DENV感染患者的單克隆抗體和4G2所進行的競爭性結合 ELISA測定的結果。
[0021] 圖11顯示了使用DI/II和DIII進行的并使用來自于DENV感染患者的單克隆抗 體進行探測的蛋白質免疫印跡測定的結果。
[0022] 圖12顯示了來自于DENV感染患者的單克隆抗體作圖到E蛋白晶體結構上的殘 基。
[0023] 圖13顯示了 DENV-I至4與黃熱17-D包膜蛋白的氨基酸序列比對。
[0024] 圖14顯示了 DENV包膜蛋白的蛋白質晶體結構并顯示了融合環（黑色）及5A (綠 色）和14A (鴨綠色）周圍的氨基酸的位置。
【具體實施方式】
[0025] 對于公共衛生官員而言，由登革熱病毒感染所產生的嚴重并發癥的出現已經成為 日益嚴重的問題。登革出血熱（DHF)和休克綜合癥（DSS)兩者都是與預先存在的針對異源 登革熱病毒血清型的免疫性的存在有關的臨床結果。登革出血熱最初的特征在于持續3-5 天的輕微發熱病癥。患者在退熱期可能會惡化至帶有凝血障礙和血管通透性增加并常常伴 有內部出血和休克的綜合癥的下個階段。自從其首次在泰國被確認以來，據報道多達150 萬的兒童因該綜合征住院，其中有33, 000例死亡（世界衛生組織，1989)。DHF/DSS此后繼 續存在，并且其爆發會給許多國家的公共衛生造成重大問題。
[0026] 登革熱病毒（DENV)是蚊子傳播的病毒，并在地理范圍以及疾病嚴重程度上不斷 擴大。存在四種不同的引起相似疾病癥狀的登革熱血清型，血清型1-4。單一血清型的感染 導致針對相同血清型的保護性免疫應答，但會引起針對其他血清型（以及其他黃病毒）的 交叉反應性抗體應答。流行病學研宄顯示，在后續感染不同的血清型期間，交叉反應性抗體 的存在與更加嚴重的疾病結果有關。該效應的機制似乎是表達Fc受體的巨噬細胞和巨噬 細胞樣細胞的感染的抗體依賴性增強。正常情況下，這些細胞不會被登革熱病毒有效感染， 但是在存在登革熱病毒結合性抗體的情況下變得高度易受感染，所述抗體隨后通過抗體重 鏈和細胞Fc受體的相互作用使病毒粒子直接靶向至巨噬細胞。
[0027] 一些研宄試圖通過表征人抗登革熱單克隆抗體來確定針對登革熱病毒的人抗體 應答。在本研宄之前，關于登革熱感染的大部分免疫學研宄都是在小鼠中進行的，而小鼠并 不是登革熱的天然宿主并且會產生非常不同的抗體應答。人類研宄中得出的結論之一是， 針對登革熱病毒的表面蛋白、膜蛋白（prM和M)和包膜蛋白（E，可溶性包膜蛋白，sE)的主 要人抗體應答是非中和性的，并對登革熱的四種血清型具有交叉反應性。這些非中和性、交 叉反應性的抗體是疾病的抗體依賴性增強的主要原因。這為利用整個prM和E蛋白的登革 熱疫苗的開發帶來了問題。即使利用全長PrM和E的疫苗制劑能夠誘導針對所有四種血清 型的廣譜中和性應答，當中和性抗體應答隨著時間推移減少時，占據優勢的非中和性應答 將繼續保留并使疫苗接受者面臨嚴重的疾病，如果他們再次受到感染的話。尚不清楚中和 性疫苗應答會持續多長時間或者疫苗接受者可能在何時會有疾病增強的風險，但是幾乎沒 有能夠誘導終生保護的疫苗的實例。
[0028] 本發明涉及嵌合蛋白，以及生產用于對個體進行免疫以針對登革熱和登革熱臨床 結果的嵌合蛋白的方法，以及用于治療易受登革熱病毒感染或被登革熱病毒感染的個體的 方法。在一些實施方式中，嵌合蛋白可用于制造用于感染個體的治療組合物，而在其他實施 方式中，嵌合蛋白可用于生產活的減毒疫苗或者不具備復制性的亞單位疫苗。
[0029] 嵌合蛋白通過用任意的登革熱病毒（DENV)(黃病毒屬登革熱病毒（Flavivirus denguebirus))株的包膜蛋白的一部分取代黃熱病毒（YFV)(黃病毒屬黃熱病毒 (Flavivirus yellow fever virus))包膜蛋白的一部分來制造。在一個實施方式中， 使用YFV17D株的包膜蛋白來制造本發明的嵌合蛋白。雖然該實例被限定為YFV包膜蛋 白，但在其他實施方式中可以設想的是，可以使用任何黃病毒例如西尼羅河病毒（West Nile Virus)、圣路易斯腦炎病毒（St. Louis encephalitis)、登革熱病毒、日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis)和昆津病毒（Kunjin virus)的包膜蛋白并且取代四種DENV株 中任意一種的包膜蛋白來制造嵌合蛋白。
[0030] YFV17D株的包膜蛋白具有被鑒定為SEQ ID NO. 1的如下序列：
[0031] AHCIGITDRDFIEGVHGGTWVSATLEQDKCVTVMAPDKPSLDISLETVAIDRPAEVRKVCYNAVLTHVK INDKCPSTGEAHLAEENE⑶NACKRTYSDRGWGNGCGLFGKGSIVACAKFTCAKSMSLFEVDQTKIQYVIRAQLHVG AKQENWNTDIKTLKFDALSGSQEVEFIGYGKATLECQVQTAVDFGNSYIAEMETESWIVDRQWAQDLTLPffQSGSGG VffREMHHLVEFEPPHAATIRVLALGNQEGSLKTALTGAMRVTKDTNDNNLYKLHGGHVSCRVKLSALTLKGTSYKIC TDKMFFVKNPTDTGHGTVVMQVKVSKGAPCRIPVIVADDLTAAINKGILVTVNPIASTNDDEVLIEVNPPFGDSYII VGRGDSRLTYQWHKEGSSIGKLFTQTMKGVERLAVMGDTAWDFSSAGGFFTSVGKGIHTVFGSAFQGLFGGLNWITK VIMGAVLIWVGINTRNMTMSMSMILVGVIMMFLSLGVGA
[0032] DENV株I的包膜蛋白具有被鑒定為SEQ ID NO. 2的如下