嵌合成纖維細胞生長因子21蛋白及其使用方法
【專利說明】嵌合成纖維細胞生長因子21蛋白及其使用方法
[0001] 本申請要求2012年6月7日提交的美國臨時專利申請No. 61/656, 778、2012年6 月25日提交的美國臨時專利申請No.61/664, 081和2013年3月15日提交的美國專利申 請系列No. 13/837, 880的優先權利益，將所述美國臨時專利申請或美國專利申請系列的每 一個案子通過引用全文并入本文。
[0002] 本發明是利用在由美國國立衛生研宄院授予的基金號DE13686、DK077276、 AG019712、DK091392和DK067158下的政府資助進行的。政府在本發明中具有某些權利。 發明領域
[0003] 本發明涉及嵌合成纖維細胞生長因子（"FGF"）蛋白及其用途。
[0004] 發明背景
[0005] 2型糖尿病是慢性進行性病癥，其由與胰腺的不充足胰島素分泌組合的終末器官 對胰島素的作用的抵抗引起。與胰島素抗性和分泌缺陷相關的代謝異常，特別地高血糖 癥在數年的過程中導致對多個器官包括心臟、血管、腎和眼的廣泛的不可逆轉的損傷。目 前，將近2億或2. 9%的世界人口具有2型糖尿病（世界衛生組織，Diabetes Fact Sheet N。312, 2011年 1 月；Wild 等人，"Global Prevalence of Diabetes:Estimates for the Year 2000and Projections for 2030,'Diabetes Care 27 (5) :1047-1053 (2004))，其流行 正以令人擔憂的快速步伐上升，與之并行的是超重和肥胖癥流行的上升（世界衛生組織， Diabetes and Overweight Fact Sheet N。311,2011年 1 月）。直至 20世紀末，僅在成 人中觀察到2型糖尿病，但曾經稱為"成年型糖尿病"的2型糖尿病現也在兒童和青少年中 得到診斷，該日益增加的發病率可能與兒童和青少年中的超重和肥胖癥的增加相關。前期 糖尿病（正常葡萄糖動態平衡與糖尿病之間的中間代謝期）的流行甚至比2型糖尿病的流 行更普遍。目前，僅在美國就有接近8000萬或26%的人口具有前期糖尿病（疾病預防控 制中心，National Diabetes Fact Sheet2011)，這樣就處于進展至2型糖尿病的高風險中。 2型糖尿病列于世界死亡的10個首要原因之列，世界衛生組織預計在下一個10年內因糖 尿病（其90%為2型）引起的死亡率將超過2倍（世界衛生組織，Diabetes Fact Sheet N° 312, 2011年1月）。2型糖尿病也是失能的主要原因。作為糖尿病視網膜病變的結果， 世界上約10%的所有糖尿病患者發生嚴重性視覺病癥，并且2%失明在15年內形成疾病 (世界衛生組織，Diabetes Fact Sheet N° 312,2011年1月）。在世界范圍內影響高達一 半的所有糖尿病患者（世界衛生組織，Diabetes Fact Sheet N° 312, 2011年1月）的糖 尿病神經病變占據大部分非創傷性下肢截肢。事實上，在其最近公布的關于非傳染性疾病 的第一世界報告中，世界衛生組織認為糖尿病與其它慢性非傳染性疾病如癌癥和心臟病一 起是全球經濟和社會負擔，其超過因傳染性疾病例如HIV/AIDS施加的負擔。
[0006] 2型糖尿病的當前藥物療法集中在糾正患者的高血糖癥。雖然許多具有不同抗 高血糖作用機制的小分子和生物制品可獲得用作單一療法或聯合治療，這些藥物的大多數 (如果不是全部的話）具有有限的功效、有限的耐受性和顯著的有害效應（Moller，"New Drug Targets f or Type 2Diabetes and the Metabolic Syndrome, " Nature 414(6865) :821-827(2001))。例如，利用磺脲類、格列奈、噻唑啉二酮或胰島素的治療與體 重增長相關，這是不期望的作用，因為超重被認為是2型糖尿病發病機制的驅動力。這些治 療中的一些治療也與增加的低血糖癥風險相關。對噻唑啉二酮的特殊限制是有可能引起不 利的心血管效應（DeSouza 等人，"Therapeutic Targets to Reduce Cardiovascular Di sease in Type ZDiabetes^iNat Rev Drug Discov 8 (5) :361-367 (2009))。關于噻挫燒二 酮類藥物羅格列酮（Avandiali )(其被廣泛用于2型糖尿病的治療）的臨床數據的元分析 發現藥物增加2型糖尿病患者的心肌梗塞的風險（Nissen等人，"Effect of Rosiglitazone on the Risk of Myocardial Infarction and Death from Cardiovascular Causes, "NE ngl J Med 356(24) :2457-2471(2007))。在所有糖尿病并發癥中，心血管疾病是糖尿病患 者的發病率和死亡率的主要原因（世界衛生組織，Diabetes Fact Sheet N° 312, 2011年 1月國；疾病預防控制中心，National Diabetes Fact Sheet 2011)，因此藥物治療對心血 管風險的加重是絕對不可接受的。在噻唑啉二酮的心血管安全的辯論之后不久，FDA頒布 了關于評價治療2型糖尿病的新型抗糖尿病療法的心血管危險的指導（Opar A，"Diabetes Drugs Pass Cardiovascular Risk Check1^at Rev Drug Discov 8 (5) : 343-344 (2009)) 〇 同時，噻唑啉二酮失去了它們的受歡迎程度。即使對于胰高血糖素樣肽I激動劑，被引入 用于治療2型糖尿病的最新種類的藥物之一，已引起關于安全性的關注，即致癌性的潛能 (Opar A, "Diabetes Drugs Pass Cardiova scular Risk Check, ''Nat Rev Drug Discov 8(5):343-344(2009))。因此，需要比現有藥物更有效更安全的新型療法。由于目前可用的 藥物不直接靶向晚期糖尿病的并發癥，特別地心血管疾病，因此特別期望不僅在降低血糖 上有效而且還降低心血管風險因子例如血脂異常的療法。
[0007] 由Eli Lilly&Co.進行的關于治療2型糖尿病的潛在新型生物治療劑的研宄導 致作為以不依賴胰島素的方式刺激葡萄糖至脂細胞的吸收的蛋白的成纖維細胞生長因子 (FGF)21 的發現（Kharitonenkov 等人，"FGF_21as a Novel Metabolic Regulator, "J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005))QFGF21此后出現為不僅葡萄糖代謝而且還 有脂質代謝的至關重要的內分泌調節劑，并且已成為用于治療2型糖尿病、肥胖癥和代 謝綜合征的最有前景的藥物候選者之一。在糖尿病和肥胖癥的小鼠模型中，藥物劑量 的FGF21降低血糖，增強葡萄糖耐受性和胰島素敏感性，并且增強了胰腺β-細胞功 能（Kharitonenkov 等人，"FGF_21as a Novel Metabolic Regulator," J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005) ;Coskun 等人，"Fibroblast growth factor 21corre cts obesity in mice,'Endocrinology 149(12):6018-6027(2008) ;Wen te 等人，"Fibroblast Growth Factor-21Improves Pancreatic Beta-Cell Function and Survival by Activation of Extracellular Signal-Regulat ed Kinase l/2and Akt Signaling Pathways, "Diabetes 55:2470-2478(2006))。同時，FGF21 降低血漿甘油三酯和膽固 醇，增強脂解和抑制脂肪生成，加帶能量消耗，和逆轉脂肪肝疾病（Kharitonenkov等人， "FGF-21as a Novel Metabolic Regulator, "J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005); Coskun等人，"Fibroblast growth factor 21corrects obesity in mice, Endocrinology 149(12):6018-6027(2008) ;Xu 等人，"Fibroblast Growth Factor 21Reverses Hepatic Steatosis, Increa ses Energy Expenditure, and Improves Insulin Sensitivity in Diet-In duced Obese Mice, "Diabetes 58:250-259(2009))。在肥胖小鼠中，F GF21 引 起體重減輕，在瘦小鼠中，其為對體重具有中性作用（Kharit onenkov等人，"FGF-21as a Novel Metabolic Regulator, "J Clin In vest 115(6):1627-1635(2005) ;Coskun 等人，"Fibroblast growth facto r 21corrects obesity in mice,''Endocrinology 149(12) :6018-6027 (2008))。因此，FGF21具有一些用于治療2型糖尿病的藥物的最期望的 特征；其不僅增強血糖控制，而且還直接影響心血管危險因子，例如高甘油三酯血癥，和減 輕肥胖，所述肥胖被認為是2型糖尿病的單一最重要促進因子。重要地，FGF21不誘發低血 糖癥（Kharitonenkov 等人，"FGF_21as a Novel Metabolic Regulator," J Clin Invest 115 (6) : 1627-1635 (2005))，其為可隨幾種目前的抗糖尿病療法包括胰島素發生的副作用。 此外，FGF21在小鼠中未顯示任何有絲分裂促進活性（Kharitonenkov等人，"FGF-21as a Novel Metabolic Regulator, "J Clin Invest 115(6):1627_1635(2005))，從而排除致 癌危險性的可能性。在糖尿病小鼠模型中關于FGF21療法的發現已在糖尿病恒河猴中重 現（Kharitonenkov 等人，"The Metabolic State of Diabetic Monk eys is Regulated by Fibroblast Growth Factor-21," Endocrinology 148 (2) :774-781 (2007))，并且在人 中目前通過臨床試驗進行隨訪（Kharit onenkov等人，"FGF21Reloaded:Challenges of a Rapidly Growing Field, "Trends Endocrinol Metab 22(3) :81-86(2011)) OFGF21 療法還 導致促炎細胞因子的血清水平的降低，這可促成增強的胰島素敏感性（Kharitonenkov等 人，"The Metabolic State of Diabetic Monkeys is Regulated by Fibroblast Growth Factor-21, " Endocrinology 148 (2) : 774-781 (2007))并且還可能賦予 FGF21 抗動脈粥樣 硬化性質。然而，仍然存在對更有效的FGF21治療劑的需要。
[0008] 本發明克服了本領域的這些和其它不足。
[0009] 發明概述
[0010] 本發明的一個方面涉及嵌合蛋白。嵌合蛋白包括偶連于C末端的N末端，其中N 末端包括旁分泌成纖維細胞生長因子（"FGF"）的一部分并且C末端包括FGF21分子的C 末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修飾來相較于無修飾的部分減小針對肝素和/或硫酸 類肝素的結合親和力。
[0011] 本發明的另一個方面涉及用于治療患有病癥的受試者的方法。該方法包括選擇患 有病癥的受試者和提供嵌合FGF蛋白，其中嵌合FGF蛋白包括偶連于C末端的N末端。N末 端包括旁分泌FGF的一部分并且C末端包括FGF21的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分 被修飾來相較于無修飾的部分減小針對肝素和/或硫酸類肝素的結合親和力。該方法還包 括在對于治療病癥是有效的條件下給選擇的受試者施用治療有效量的嵌合FGF蛋白。
[0012] 本發明的另一個方面涉及產生具有增強的內分泌活性的嵌合FGF蛋白的方法。該 方法包括將一個或多個修飾引入FGF蛋白，其中修飾減小FGF蛋白對肝素和/或硫酸類肝 素的親和力并將Klotho共受體結合結構域偶連于修飾FGF蛋白的C末端，由此產生具有增 強的內分泌活性的嵌合FGF。
[0013] 本發明的另一個方面涉及有利于成纖維細胞生長因子受體（"FGFR"）-0 Klotho 共受體復合物形成的方法。該方法包括提供包括β Klotho共受體和FGFR的細胞和提供嵌 合FGF蛋白。嵌合FGF蛋白包括FGF21的C末端和旁分泌FGF的一部分，其中旁分泌FGF 的所述部分被修飾來相較于不具有所述修飾的部分減小針對肝素和/或硫酸類肝素的親 和力。該方法還包括在對于引起FGFR-β Klotho共受體復合物形成是有效的條件下將細胞 與嵌合FGF蛋白接觸。
[0014] 然而本發明的其它方面涉及篩選能夠在病癥的治療中有利于FGFR-β Klotho復 合物形成的試劑的方法。該方法包括提供包括偶連于C末端的N末端的嵌合FGF，其中N末 端包括旁分泌FGF的一部分，并且C末端包括FGF21的C末端。旁分泌FGF的所述部分被 修飾來相較于不具有所述修飾的部分，減小針對肝素和/或硫酸類肝素的結合親和力。該 方法還包括提供二元β Klotho-FGFR復合物和提供一種或多種候選試劑。該方法還包括 在這樣的條件下組合嵌合FGF、二元β Klotho-FGFR復合物與一種或多種候選試劑，所述條 件允許在所述一種或多種候選試劑不存在的情況下形成嵌合FGF與二元β Klotho-FGFR復 合物之間的三元復合物。該方法還包括將一種或多種候選試劑鑒定為適合用于治療病癥， 所述候選試劑相較于在一種或多種候選試劑不存在的情況下的二元復合物形成，減少嵌合 FGF與二元β Klotho-FGFR復合物之間的三元復合物形成。
[0015] 成纖維細胞生長因子（FGF) 19、21和23為以Klotho共受體依賴性方式調節主要 代謝過程例如葡萄糖和脂質代謝（FGF21)以及磷酸鹽和維生素 D動態平衡（FGF23)的激 素。硫酸類肝素糖胺聚糖在內分泌FGF的細胞表面信號復合物的形成中的作用還不清楚。 為破譯HS在內分泌FGF信號轉導中的作用，我們產生缺乏HS結合的FGF19和FGF23突變 型配體，并將它們的信號轉導能力與野生型配體的相比較。本文中提供的數據顯示突變配 體保持完全代謝活性，從而證明HS不參與內分泌FGF信號復合物的形成。此處顯示硫酸類 肝素不是FGF19和FGF23的信號轉導單位的組分。通過減小旁分泌FGF的硫酸類肝素結合 親和力，并用其C末端尾替代包含Klotho共受體結合位點的內分泌FGF的C末端尾以使配 體回到靶組織中來將旁分泌FGF轉化成內分泌配體。配體轉為工程化內分泌FGF-樣分子 以治療代謝病癥，包括全球流行病例2型糖尿病和肥胖癥提供新型策略。
[0016] 附圖簡述
[0017] 圖1A-1D為顯示FGF2、FGF19和FGF23的HS結合位點的并排比較以及內分泌FGF 信號轉導復合物的兩個工作模型的示意圖。圖IA顯示在2:2FGF2-FGFRlc二聚體的晶體結 構（PDB ID: 1FQ9; (Schlessinger 等人，Moh Cell 6:743-750(2000)，將其通過引用全文并 入本文））中觀察到的FGF2(圖示）與肝素己糖（以圖棒顯示的）的相互作用。肝素己糖 由3個1 - 4連接的N-硫酸化-6-0-硫酸化D-葡糖胺和2-0-硫酸化L-艾杜糖醛酸的二 糖單位組成。注意，肝素己糖與FGF2的HS結合位點中的殘基的側鏈和骨架原子相互作用。 虛線表示氫鍵。將與肝素己糖產生大部分氫鍵的K128、R129和K134加框。β -鏈命名遵 循最初的 FGFl 和 FGF2 晶體結構（Ago 等人，J. Biochem. 110:360-363(1991) ;Eriksson 等 人，Proc. Nat' I. Acad. Sci. U.S.A. 88:3441-3445 (1991) ;Zhang 等人，Proc. Nat' I. Acad Sci. U. S. A. 88:3446-3450 (1991) ;Zhu 等人，Science 251:90-93 (1991)，將其通過引用 全文并入本文）。請注意，相較于在大豆胰蛋白酶抑制劑（PDB ID:lTIE;(Onesti等人， J. Mol. Biol. 217:153-176(1991)，將其通過引用全文并入本文））和白細胞介素 I MPDB ; (Finzel 等人，J. Moh Bioh 209:779-791 (1989)，將其通過引用全文并入本文）） 中看到的典型β-三葉形折疊，在FGF2和其它旁分泌FGF中配對的βΙΟ-β 11鏈界線不太 明確。圖IB和IC顯示了在圖IA中以與FGF2結構相同的取向顯示的FGF19(PD