一種轉基因大豆mon89788的恒溫探針法檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學技術領域，涉及轉基因植物品種的檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及一種轉基因大豆M0N89788的恒溫探針法檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]自轉基因作物投入商業化種植來，全球轉基因作物種植面積累計已經超過10億公頃。2010年，全球29個國家的1540萬農民種植了共1.48億公頃的轉基因作物。自1996年至2010年，全球轉基因作物的種植面積增加了 87倍。種植轉基因作物排名前十位的國家種植面積首次均超過了 100萬公頃。目前，世界各國已進行田間試驗的轉基因作物超過5000種，批準商品化的轉基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、木瓜、甜菜、煙草、水稻等。從世界范圍看，轉基因的推廣已經帶來了巨大的社會和經濟效益。然而轉基因糧食在帶來巨大社會和經濟效益的同時也存在許多問題，主要集中在轉基因食品的安全性以及對生態環境的安全性方面，包括對人和動物健康的風險，對生態環境與農業的風險，對非目標生物的風險。近來在全球范圍內引起場轉基因生物安全性的爭論，支持和反對兩派爭鋒相對，勢不兩立，為便于消費者區分及選購，各國分別提出對轉基因食品進行標識管理，并對最低含量作出規定。因此建立快速有效的檢測方法體系，對作物及食品進行區分尤為重要。
[0003]目前轉基因作物的檢測主要是檢測樣品是否含有外源蛋白質(基因表達產物)和是否含有外源基因(DNA)。轉基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶聯免疫吸附法(ELISA)試紙條檢測、Western雜交等方法檢測，但是這種方法要求高質量高穩定性的抗體，否則因準確性不夠，只能作為輔助檢測手段，另因檢測靶標是蛋白，經深加工的食品蛋白已發生變性，故外源蛋白質檢測方法對于深加工的食品檢測具有一定局限性。轉基因作物的核酸檢測方法主要有PCR檢測技術、恒溫檢測技術。然而PCR檢測技術存在如下問題，1)PCR方法反應體系和操作過程比較復雜，需要專業人員；2)所需PCR儀價格昂貴，檢測時間長；3)電泳常用染料EB為強致癌物質，有較強毒性，且難以實行現場檢測，所以PCR檢測技術在基層仍未得到推廣應用。
[0004]恒溫基因擴增技術具有快速簡便、操作準確、容易普及、安全可靠的優點，自建立來已得到廣泛的應用，并在原基礎上發展出采用SYBR Green染色法、鈣黃綠素法、濁度法、熒光染料法等不同結果伴讀方法，適合現場及快速檢測，已在基層得到推廣應用，但所采用的SYBR Green染色法、鈣黃綠素法、濁度法、熒光染料法等在檢測原理上具有先天的不足，都以核酸擴增產物或副產物為靶標進行直接檢測，如檢測中所發生的是非特異擴增，檢測結果仍為陽性結果，即以上的測試方法存在檢測結果為假陽性的問題(特異性差的問題)，開發一種可避免假陽性的轉基因檢測試劑盒是目前亟待解決的難題。
[0005]為避免假陽性擴增，本發明在檢測引物組中引入特異性分子探針，該探針可實時與產物擴增產生的靶標片段特異性結合并發出熒光信號，如擴增產物為非靶標基因，該探針不與擴增的產物進行結合，無熒光信號發出，檢測結果仍為陰性。該檢測方法克服恒溫檢測技術的不足，將進一步引領恒溫檢測技術的在檢測中的推廣應用。
【發明內容】
[0006]本發明的一個目的在于提供一種轉基因大豆M0N89788的恒溫檢測試引物組。
[0007]本發明的另一個目的在于提供一種轉基因大豆M0N89788的恒溫檢測試劑盒。
[0008]本發明的另一個目的在于提供一種轉基因大豆M0N89788的恒溫檢測方法。。
[0009]本發明所采用的技術方案如下:
轉基因大豆M0N89788的恒溫檢測引物組，包括外引物I和外引物2、內引物I和內引物2、環引物和探針引物，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 1:5’ - TTGTTCCTGCTCCACTCT-3’ ；
外引物 2:5’ - TTCTTCATTGATCTCCTGTAGC-3，；
內引物 1:5’ - AGCTAGAGCTTGATGGGGATCACGTGGTTATCAAGCTCCAA-3’ ；
內引物 2:5’ - CCGCGTTATCAAGCTTCTGCCTTGTTGAGGCTTTGGACT-3’ ；
環引物:5’ - GTCCTGCTCGAGTGGAAG-3’ ；
探針引物:FAM- ATCGA ATTGTCGTTTCCCGCCTTTCGAT -BHQ-1。
[0010]一種轉基因大豆M0N89788的恒溫檢測試劑盒，其包括如上所述的恒溫檢測引物組。
[0011]所述試劑盒中還包括:DNA聚合酶、LAMP反應液、陽性對照和陰性對照。
[0012]所述LAMP反應液包括1mM dNTP、150mM MgSOjK溶液，二者的體積比是7?9:
2?4。
[0013]所述陽性對照為轉基因大豆M0N89788的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液。
[0014]一種轉基因大豆M0N89788的檢測方法，包括如下步驟:
(I)提取待檢樣品DNA。
[0015](2)恒溫基因擴增反應:利用權利要求1所述的恒溫檢測引物組對待檢樣品進行恒溫擴增，擴增時將檢測管放置在可提供恒溫及熒光檢測的儀器上，每30?60s采集一次焚光信號；
恒溫基因擴增反應體系的25 μ I反應體系含有:內引物I 0.2 μ Μ，內引物2 0.2 UMjF引物I 1.6 μΜ，外引物2 1.6 μΜ，環引物0.8 μΜ，探針引物0.8 μΜ，LAMP反應液12.5 μ 1，DNA聚合酶8U，待檢樣品DNA 2 μ I，用超純水補齊到25 μ I ;
恒溫基因擴增反應的程序為:60?63°C反應20?60min。
[0016](3)結果判斷:根據有無“S”型擴增曲線判斷陰陽性結果，有“S”型擴增曲線為陽性結果，反之為陰性結果。
[0017]本發明的有益效果在于:
本發明基于恒溫擴增技術，在引物組中引入特異性探針引物，可實時監測反應的過程，并可有效降低假陽性的發生，該發明具有高特異性、高靈敏度、鑒定簡便、快速高效、操作簡便等有益效果: (1)高特異性:本發明根據轉基因大豆M0N89788的外源基因與內源基因結合處設計了5條特異性引物，應用上述5條引物，擴增靶序列，具有很強的品系特異性，同時在引物體系中引入特異性探針引物，只有特異性探針引物與擴增靶片段結合時才有熒光信號發出，儀器才判為陽性，有效的進一步提高特異性，避免因形成引物二聚體及非靶標基因擴增造成的假陽性；
(2)快速高效:整個擴增只用20?60min即可完成，擴增產量可達19?101(1個拷貝；
(3)操作簡便:擴增完成后，無需電泳，開蓋加入熒光染料，儀器可根據熒光探針與擴增靶標結合發出的熒光信號自動判讀檢測結果；
(4)尚靈敏度:最低檢測極限可達到0.01%。
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例3靈敏度檢測圖；
圖2為實施例4特異性檢測圖；
圖3為實施例5實際樣品檢測圖。
【具體實施方式】
[0019]以下結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0020]實施例1轉基因大豆M0N89788的恒溫檢測試劑盒的建立轉基因大豆M0N89788的恒溫檢測試劑盒，包括如下組分:
(I) LAMP檢測引物組，引物序列如下所示:
外引物 1:5，- TTGTTCCTGCTCCACTCT-3’ (SEQ ID N0.1)；
外引物 2:5，- TTCTTCATTGATCTCCTGTAGC-3，(SEQ ID N0.2)；
內引物 1:5’ - AGCTAGAGCTTGATGGGGATCACGTGGTTATCAAGCTCCAA-3’ (SEQ ID