一種快速檢測禽源樣品中沙門菌的lamp試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學檢測技術領域，涉及一種快速檢測禽源樣品中沙門菌的 LAMP試劑盒，具體為一種快速檢測禽源樣品中雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌與腸炎沙門菌 的LAMP試劑盒。
【背景技術】
[0002] 沙門菌（Salmonella)是腸桿菌科中最常見的人畜共患病原菌，常寄生于動物和 人體腸道內。由沙門菌引起的食物中毒是所有細菌性食物中毒中比例最高，危害最廣的一 種。沙門菌感染的禽群，是那些能夠通過食物鏈傳給人的沙門菌最為常見的儲存庫之一。 從家禽和禽產品中分離出沙門菌的報道明顯多于其它動物，造成這一結果的主要原因是由 于沙門菌在被感染的家禽中能通過水平傳播和垂直傳播造成廣泛流行，同時也反映出家禽 的飼養數量十分龐大。大量的研宄數據表明，不同宿主來源的沙門菌血清型存在較大的差 異，對禽源沙門菌的流行病學研宄表明，其優勢血清型主要集中于雞白痢沙門菌、雞傷寒沙 門菌、腸炎沙門菌等幾種嚴重危害家禽養殖業與人類健康的血清型，因而針對上述禽源優 勢血清型沙門菌開發特異性的檢測技術對于防控禽源沙門菌的傳播具有重要的意義。
[0003] 由于傳統的沙門菌檢測技術上存在諸多缺陷，如：操作步驟煩瑣耗時，現行的國家 標準或行業標準中對沙門菌的檢測通常需要4-6天，已不能滿足及時有效的質量監測和疾 病防控需求；靈敏度較低，當樣品中沙門菌含量較低時，易造成假陰性結果；準確度不高， 尤其是加工后的食品受加熱、干燥、高鹽和冷凍等因素的作用，易導致沙門菌形成營養缺陷 型，用傳統方法不易檢出。因此，迫切需要研發操作簡便、準確快速的檢測技術。環介導等溫 擴增技術（LAMP)是一種新型的分子檢測方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特 異引物，利用鏈置換型DNA聚合酶，能在等溫條件下（60~65°C )、Ih內特異地擴增出IO9~ 101°拷貝靶序列。在保持傳統PCR技術優點的基礎上，進一步提高了反應的特異性，同時縮 短了檢測時間。現已被應用于多種病原微生物的檢測和研宄，并具有良好的發展前景。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有沙門菌檢測技術上存在諸多缺陷，旨在提供一種簡單、快速、準確 的檢測禽源樣品中沙門菌的LAMP試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、操作簡單的 特點。
[0005] 本發明另一目的在于提供一種用于檢測沙門菌的通用LAMP引物組。
[0006] 本發明具體通過以下技術方案實現：
[0007] -種快速檢測禽源樣品中沙門菌的LAMP試劑盒，包括：
[0008] I) 10 X LAMP 緩沖液；
[0009] 2) 8000U/mL BstDNA 聚合酶；
[0010] 3) IOmMdNTPs;
[0011] 4)LAMP引物組：外引物濃度為Spmol/yL，外引物為F3和B3 ;內引物濃度為 40pmol/ μ L，內引物為FIP和BIP ;環引物濃度為20pmol/ μ L，環引物為LF和LB ;
[0012] 5)無菌去離子水；
[0013] 6)熒光染料：10 X SYBR Green I ;
[0014] 7)陽性對照：腸炎沙門菌標準株ATCC13076基因組DNA ;
[0015] 8)陰性對照：無菌去離子水。
[0016] 所述的 10XLAMP 緩沖液含有 200mM Tris-HCl(pH 8.8,25°C )、100mM 氯化鉀、 IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂、8M甜菜堿和體積百分濃度為1 %的曲拉通X-100。
[0017] 所述的外引物F3和B3序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，所述的內引物 FIP和BIP序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，所述的環引物LF和LB序列如SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
[0018] 本發明待檢樣品基因組DNA按常規方法提取或試劑盒提取。
[0019] 本發明試劑盒LAMP檢測反應體系為：每25 yL反應液中，5pmol/yL的F3和B3 各 1 μ L，40pmol/ μ L 的 FIP 和 BIP 各 1 μ L，20pmol/ μ L 的 LF 和 LB 各 1 μ L，Bst DNA 聚合 酶1 μ L，lOmmol/L的dNTPs 3. 5 μ L，待檢樣品DNA 2~3 μ L，無菌去離子水適量。
[0020] 本發明試劑盒采用熒光目視法時，需在反應體系中添加10XSYBR Green I 2. 5 μ L，反應體系總量保持25. 0 μ L不變。
[0021] 本發明LAMP反應條件為：66°C恒溫反應50min，并在80°C持續10min。
[0022] 本發明所述的沙門菌為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌或腸炎沙門菌中的一種或幾 種。
[0023] 本發明試劑盒反應完成后肉眼觀察液體變混濁（如果加入熒光染料則顏色由橙 色變為綠色），則說明樣品中含有雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌與腸炎沙門菌中的一種或幾 種；或使用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性則可呈現典型的特異梯狀條帶，陰性則無此 現象。
[0024] 本發明還提供了一種用于檢測沙門菌的通用LAMP引物組，包括：外引物F3和B3 ; 內引物FIP和BIP ;環引物LF和LB。
[0025] 所述的沙門菌為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌或腸炎沙門菌中的一種或幾種。
[0026] 本發明的試劑盒LAMP檢測方法具有以下優點：
[0027] 1)快速高效：整個擴增過程僅需35~50min，擴增產量可達IO9~10 1(1個拷貝靶 序列；
[0028] 2)操作便捷：不需要復雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變 性等繁瑣步驟，只需要普通水浴鍋即可進行檢測；
[0029] 3)特異性強：本發明根據三種禽源沙門菌（雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌與腸炎 沙門菌）含有的特異基因序列設計6條特異性引物，應用上述引物，擴增靶序列的6個區 域，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高，且非常穩定， 形成引物二聚體概率低，確保反應的順利進行；
[0030] 4)靈敏度高：最低檢測極限可達到0. 5~0. 6pg/管，比普通PCR高1-2個數量級；
[0031] 5)適合現場檢測：肉眼觀察液體變渾濁即為陽性，澄清透明則為陰性；若采用熒 光目視法觀察顏色變化，顏色變為綠色為陽性，橙色為陰性；或使用2 %濃度瓊脂糖凝膠電 泳檢測，陽性可呈現典型的特異梯狀條帶，陰性無此現象。
[0032] 本發明的LAMP檢測方法具有快速高效、操作簡便、特異性強、靈敏度高、適合現場 檢測等優點，不需要配置相關檢測儀器，為禽源沙門菌的檢測提供了新的技術支撐，可用于 畜牧業生產單位、獸醫檢測實驗室、屠宰場、出入境和各疾病預防控制中心篩查和檢測，具 有廣闊的市場前景，適于推廣應用。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發明LAMP檢測方法的外引物與內引物比例優化試驗結果圖；M為 DL-5000marker，泳道號1-6分別為外、內引物比1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,1:10,泳道7為陰性 對照；
[0034] 圖2為本發明LAMP檢測方法的外引物與環引物比例優化試驗結果圖；M為 DL-5000marker，泳道號1-6為外、環引物比1: 1，1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,泳道7為陰性對 昭.
[0035] 圖3為本發明LAMP檢測方法的引物缺省試驗結果圖；M為DL-5000marker ;1-11分 另IJ為引物內外環引物全有、；無上游外引物F3 ;無下游外引物B3 ;無上、下游外引物F3、B3 ; 無上游內引物FIP ;無下游內引物BIP ;無上、下游內引物FIP、BIP ;無上游環引物LF ;無下 游環引物LB ;無上、下游環引物LF、LB ;內外環引物都無；泳道12為陰性對照；
[0036] 圖4為本發明LAMP檢測體系中不同濃度Mg2+試驗結果圖；M為DL-5000marker ; 1-6 分別為濃度 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM 的 MgS04;7 為陰性對照；
[0037] 圖5為本發明LAMP檢測體系中不同濃度Bst DNA聚合酶試驗結果圖；M為 DL_5000marker ; 1-6 分別對應 BstDNApolymerase 添加量依次為 0· 4、0· 6、0· 8、1. 0、1· 2、 1. 4 μ L ;7為陰性對照；
[0038] 圖6為本發明LAMP檢測體系中不同濃度dNTPs試驗結果圖；M為DL-5000marker ; 1-7分別對應反應體系