一種基于dna自組裝和g四聚體的分子檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于核酶的分子檢測方法，特別涉及基于DNA自組裝和G四聚體的分子檢測方法及基于該方法的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]環境中存在多種對人體有害的分子，快速、低成本地檢測出這些有害小分子具有非常實際的意義。
[0003]雙酚A (Bisphenol A，BPA)，化學名為2，2_ 二(4_羥基苯基)丙烷，主要用于合成環氧樹脂，聚碳酸酯等多種高分子材料，被廣泛用于生產各種塑料制品。雙酚A主要通過食品包裝材料、飲水杯、供水管、奶瓶以及塑料薄膜等滲入食品而進入體內，并能在生物體內富集，并且不易被降解。即使極低的濃度的雙酚A也會對內分泌系統、免疫系統、生殖系統產生一系列的不良影響。傳統的雙酚A檢測技術主要有高效液相色譜法等一些儀器分析方法，這些技術需要繁瑣的樣品前處理和昂貴的儀器，檢測成本高、費時耗力，難以用于大批量樣本的實地現場快速檢測。
[0004]另外，也有以抗體來檢測雙酚A的技術，但是抗體的制備過程麻煩，保存條件苛亥IJ，而且需要多次洗滌與分離過程，因而限制了它們的廣泛應用。
[0005]G四聚體序列是由富含G堿基的一段單鏈DNA組成，在緩沖體系和hemin (氯高鐵血紅素)存在的情況下，可折疊成G四聚體二級結構。G四聚體具有類似HRP (辣根過氧化物酶)的催化活性，可催化氧化TMB (四甲基聯苯胺)產生藍色底物，使反應溶液肉眼可見。以G四聚體來檢測雙酚A具有操作簡單，方便現場快速分析等優點。但是基于G四聚體的比色法檢測靈敏度低，需要進一步提高靈敏度。傳統的信號放大技術主要是PCR以及一系列依賴工具酶的信號擴增技術，但是酶的使用不僅增加了成本和操作步驟，而且酶的存儲也比較麻煩，因此需要研發一種無需工具酶信號擴增技術來提高檢測靈敏度。
[0006]核酸適體(aptamer，源于拉丁語)指的是經體外篩選技術SELEX (指數富集配體系統進化)篩選出的能特異結合蛋白質或其他小分子物質的寡聚核苷酸片段。它是一系列單鏈核酸分子，與特異靶分子相結合，特異性如同抗體一樣，對可結合的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種基于DNA自組裝和G四聚體的分子檢測方法及檢測試劑盒。
[0008]本發明所采取的技術方案是:
一種基于DNA自組裝和G四聚體的檢測試劑盒，包括TMB顯色緩沖液、氯高鐵血紅素、DNA雜交緩沖液，還包括如下核酸序列:
DNAl:將待測分子核酸適體的一端適當延伸，形成DNA1，延伸的核酸序列中，靠近待測分子核酸適體的核酸序列依次記為1*、2*和3*區；
DNA2:DNA2至少與DNAl的I*區域和待測分子核酸適體的部分核酸互補配對；
DNA3:具有莖環結構，其核酸序列依次為1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*區，2、3和2*、3*互補配對形成莖結構，環為4*區，1、2、3分別和DNAl的1*、2*和3*區互補配對；
DNA4:具有莖環結構，其核酸序列依次為3、4、3*、2*和4*區，4和4*區形成莖結構，環為3*和2*區，3、4、3*、2*區分別和DNA3的3*、4*、3、2區互補配對；
DNA5:依次為5*、6*和G四聚體封閉區，5*、6*區與DNA3的5*和6*區相同；
DNA6:依次為G四聚體、6、5、和2區，6、5、和2區分別和DNA3的6*、5*和2*互補配對。
[0009]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，DNA2至少與待測分子核酸適體的8個堿基互補配對。
[0010]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，I?6、I*?6*區中，每個區至少含有6個堿基。
[0011]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，DNA5的G四聚體封閉區至少與DNA6的G四聚體中的6個堿基互補配對。
[0012]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，對I?6、I*?6*區核酸序列中的至少一個核苷酸進行修飾，以在不改變堿基配對原則的情況下提高核酸序列之間的親和力。
[0013]一種雙酚A的檢測試劑盒，包括TMB顯色緩沖液、氯高鐵血紅素、DNA雜交緩沖液，還包括如下核酸序列:
DNAl:5' -CGACATCT (3*)AACCTAGC (2*)TCACTGAC (I*) CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’ (SEQ ID NO:1);
DNA2:5’-TAAGCTGGAAGCGTCAGTGA-3’ (SEQ ID NO:2);
DNA3:5’-GTCAGTGA (l)GCTAGGTT (2)AGATGTCG (3)CCATGTGTAGA (4*)CGACATCT (3*)AACCTAGC (2*)CCTTGTCA (5*)TAGAGCAC (6*)-3’ (SEQ ID NO:3);
DNA4:5’-AGATGTCG (3)TCTACACATGG (4)CGACATCT (3*)AACCTAGC (2*)CCATGTGTAGA(4*) -3’ (SEQ ID NO:4)；
DNA5:5’-CCTTGTCA (5*)TAGAGCAC (6*) TCCCTC (G 四聚體封閉區)-3’ (SEQ ID NO:
5)；
DNA6:5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGA (G 四聚體序列)GTGCTCTA (6)TGACAAGG (5)GCTAGGTT
(2)-3’ (SEQ ID NO:6)。
[0014]一種分子的檢測方法，包括如下步驟:
1)將過量DNA5和DNA6于DNA雜交緩沖液中混合反應，形成DNA5-DNA6復合物；
2)將DNAl和過量DNA2于DNA雜交緩沖液中混合反應，形成DNA1-DNA2復合體；
3)將DNA1-DNA2復合體內加入待測樣品、DNA3和DNA4，混合反應完全，得到DNA3-DNA4復合物；
4)將DNA3-DNA4復合物、DNA5-DNA6復合物、氯高鐵血紅素、TMB顯色緩沖液混合，如反應體系產生藍色底物，說明待測樣品含有待測分子；
其中，DNAl?DNA 6的序列組成如上所示。
[0015]作為上述分子檢測方法的進一步改進，DNA雜交緩沖液為Tris-HCl緩沖液，含有200 mM NaCl 以及 50 mM KCl。
[0016]作為上述分子檢測方法的進一步改進，TMB顯色緩沖液，含有26.6 mM檸檬酸，51.4mM 磷酸氫二鈉，25 mMKCl，10 mL 0.5% 的 TMB, 20 mL 30% 的 H2O2, pH=5.0。
[0017]本發明的有益效果是:
I)本發明的檢測方法及檢測試劑盒具有較高的靈敏度，對雙酚A的檢測限為I pg/mL，檢測結果肉眼可見，適于現場快速分析。
[0018]2)本發明所述的分子檢測方法應用核酸適體實現待測分子的捕捉，具有很好的特異性，其他常見的干擾物對檢測不產生影響。
[0019]3)以G四聚體作為信號報告分子，結合DNA自組裝介導的信號放大技術，可產生大量的具有催化活性的G四聚體，整個操作簡單，經濟便宜，不需要使用任何檢測儀器，不需要專業技術人員，無須培訓即可推廣使用。
【附圖說明】
[0020]圖1是DNA1-DNA2復合體在雙酚A作用下脫離的原理示意圖；
圖2是DNA3-DNA4復合體形成的原理示意圖；
圖3是顯色反應階段的原理示意圖；
圖4是不同濃度的雙酚A檢測的結果圖；
圖5是特異性實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0021]一種基于DNA自組裝和G四聚體的檢測試劑盒，包括TMB顯色緩沖液、氯高鐵血紅素、DNA雜交緩沖液，還包括如下核酸序列:
DNAl:將待測分子核酸適體的一端適當延伸，形成DNA1，延伸的核酸序列中，靠近待測分子核酸適體的核酸序列依次記為1*、2*和3*區；
DNA2:DNA2至少與DNAl的I*區域和待測分子核酸適體的部分核酸互補配對；
DNA3:具有莖環結構，其核酸序列依次為1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*區，2、3和2*、3*互補配對形成莖結構，環為4*區，1、2、3分別和DNAl的1*、2*和3*區互補配對；
DNA4:具有莖環結構，其核酸序列依次為3、4、3*、2*和4*區，4和4*區形成莖結構，環為3*和2*區，3、4、3*、2*區分別和DNA3的3*、4*、3、2區互補配對；
DNA5:依次為5*、6*和G四聚體封閉區，5*、6*區與DNA3的5*和6*區相同；
DNA6:依次為G四聚體、6、5、和2區，6、5、和2區分別和DNA3的6*、5*和2*互補配對。
[0022]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，DNA2至少與待測分子核酸適體的8個堿基互補配對，以確保DNA1-DNA2復合物的穩定性。同時DNA2與待測分子核酸適體的堿基互補配對數也不宜過多，一般不超過20個堿基互補配對，以免影響待測分子與DNAl中的核酸適體競爭性結合從而把DNA2置換下來。
[0023]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，I?6、I*?6*區中，每個區至少含有6個堿基，以確保對應區域結合的穩定性。優選的，為6?20個，更佳為6?15個、6?10個。
[0024]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，DNA5的G四聚體封閉區至少與DNA6的G四聚體中的6個堿基互補配對，封閉后的G四聚體沒有催化活性。
[0025]作為上述檢測試劑盒的進一步改進，對I?6、I*?6*區核酸序列中的至少一個核苷酸進行修飾，以在不改變堿基配對原則的情況下提高核酸序列之間的親和力。如通過鎖核酸修飾以提高堿基之間的親和力，使用較短的序列實現本發明的技術方案。
[0026]下面結合附圖，以雙酚A的檢測為例，進一步說明本發明的檢測原理:
DNA1-DNA2復合體的形成:雙酚A的核酸適體的一端適當延伸，形成DNA1，靠近核酸適體一端包含3個區域，分別是1*，2*，3*。DNA2與部分DNAl互補。將DNAl和DNA2在緩沖體系中反應一段時間，形成DNA1-DNA2復合物。在DNA1-DNA2復合物中，DNAl中的I*區域被DNA2封閉。當DNA1-DNA2反應體系中存在雙酚A時，雙酚A將與核酸適體相互作用，從而把DNA2置換下來，使DNAl中的I*區域暴露出來(原理如圖1所示)。如無雙酚A存在，DNA1-DNA2復合物穩定存在，DNAl中的I*區域無法暴露。
[0027]DNA3-DNA4復合體的形成與放大:DNA1中暴露的I*區域可作為DNA支點，將會與DNA3中的I區域互補結合，啟動DNA自組裝鏈置換反應，介導DNAl中的2*、3*區域與DNA3中的2、3區域結合，形成更長的雙鏈DNA (1-1*、2-2*、3-3*)，從而打開頸環結構的DNA3，使DNA3中的3*區域暴露(原理圖2反應a所示)。DNA4中的